本期《精準(zhǔn)前沿》欄目分享上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所蘇冰教授團隊和葉幼瓊研究員團隊發(fā)表于Nature Communications（IF =17.694）上的一篇研究[1]，本文利用單細胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、免疫熒光成像等技術(shù)手段對結(jié)直腸癌的腫瘤微環(huán)境進行深入研究，并探索腫瘤微環(huán)境在結(jié)直腸癌免疫治療中的抑制作用。研究結(jié)果提示，破壞FAP+成纖維細胞與SPP1+巨噬細胞間的互作或可改善免疫治療療效。

研究背景

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是繼肺癌和乳腺癌后的第三大常見惡性腫瘤，每年在全世界造成約800,000人死亡。目前，免疫檢查點阻斷（immune checkpoint blockade, ICB）策略已應(yīng)用于CRC治療，然而靶向PD-1的pembrolizumab（派姆單抗）僅對高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（high microsatellite instability, MSI-H）的錯配修復(fù)缺陷腫瘤有效，該類型腫瘤占轉(zhuǎn)移性CRC病例的比例<5%。因此，有必要了解CRC腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）中細胞和分子的重塑機制，尋找潛在的干預(yù)靶點以提高免疫治療的療效。

研究設(shè)計

1. 入組樣本信息：5例非轉(zhuǎn)移性CRC患者，其中2例為結(jié)腸腺癌（colonic adenocarcinoma, COAD），3例為直腸腺癌（rectal adenocarcinoma, READ）;

2. 手術(shù)獲取5例非轉(zhuǎn)移性CRC患者的腫瘤組織和鄰近正常組織，進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（10× Genomics）；

3. 取上述5例中的4例CRC患者腫瘤組織切片進行空間轉(zhuǎn)錄組測序；

4. 文章使用的公共數(shù)據(jù)庫信息：TCGA-COAD和READ隊列RNA-seq數(shù)據(jù)、GEO數(shù)據(jù)庫中12個獨立的CRC隊列RNA-seq數(shù)據(jù)以及IMvigor210公共數(shù)據(jù)集。

本文研究設(shè)計概覽圖

研究結(jié)果

1. CRC患者的腫瘤組織和配對的鄰近正常組織的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

將手術(shù)獲取的5例CRC患者的腫瘤組織及配對的鄰近正常組織進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，質(zhì)控后共獲得54,103個細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析（其中包括29,481個正常細胞，24,622個腫瘤細胞）。聚類分析注釋將這些細胞劃分為九種主要的細胞類型（圖1b-d），分別為上皮細胞（表達EPCAM和CDH1）、T/ILC細胞（表達CD3E和CD3G）、B細胞（表達MS4A1和CD79A）、漿細胞（表達SDC1和MZB1）、髓樣細胞（表達CD14和FCGR3A）、肥大細胞（表達KIT、IL1RL1和MS4A2）、內(nèi)皮細胞（表達PECAM1和CDH5）、間充質(zhì)基質(zhì)細胞（表達COL1A1和COL3A1）及神經(jīng)膠質(zhì)細胞（表達S100B和CDH2）。雖然腫瘤組織和鄰近正常組織都具有這九種細胞類型（圖1e）,但每種細胞的浸潤程度不同，可能反應(yīng)了CRC進展階段的差異。

圖1. 單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜及細胞類型注釋

2. CRC患者腫瘤組織的細胞亞群特征揭示TME的標(biāo)志特征和臨床結(jié)局的預(yù)測

為了研究腫瘤浸潤細胞亞群調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化，本文利用Molecular Signatures Database（MsigDB）的hallmark基因集分析相鄰正常組織和腫瘤組織間MSC、EC、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、髓樣細胞、T細胞和B細胞通路的變化（圖2a）。與正常組織相比，腫瘤組織中包括炎癥反應(yīng)、IL2/STAT5信號和IL6/JAK/STAT3信號在內(nèi)的免疫相關(guān)途徑，不僅在免疫細胞群（如髓樣細胞和T/ILC細胞）中富集，而且在MSC和EC中也出現(xiàn)富集，表明MSC和EC也參與抵抗CRC的免疫反應(yīng)。與正常組織相比，腫瘤的MSC、EC和髓樣細胞中缺氧的hallmark基因集更富集（圖2a）。這些特征可能反映了腫瘤缺氧區(qū)域基質(zhì)細胞的相互作用，將巨噬細胞、MSC和EC聯(lián)系起來，重塑CRC微環(huán)境。由于本文的scRNA-seq樣本量有限，作者還分析了TCGA-COAD、TCGA-READ以及GEO數(shù)據(jù)庫中12個獨立CRC隊列的RNA-seq數(shù)據(jù)，使用CIBERSORTx分析免疫細胞的浸潤情況，分析結(jié)果表明在全部隊列中，MSC和髓樣細胞間存在顯著正相關(guān)（圖2b、c）。此外，作者還評估了CRC中MSC和髓樣細胞的浸潤程度與臨床結(jié)局的相關(guān)性（圖2d、e）,結(jié)果表明MSC浸潤程度較高的CRC患者與較差的OS和PFS相關(guān)，髓樣細胞浸潤程度較高的CRC患者與較差的OS和PFS相關(guān)。

圖2. MSC和髓樣細胞在腫瘤浸潤中呈正相關(guān)，且和臨床結(jié)局相關(guān)

3. 腫瘤特異性FAP+成纖維細胞與CRC進展相關(guān)

長期以來，MSC和成纖維樣細胞被認(rèn)為是調(diào)控腫瘤發(fā)生和癌癥進展的關(guān)鍵基質(zhì)細胞類型。本文利用之前報道的特異性細胞特征marker將MSC分為10個亞型（圖3a），與鄰近正常組織相比，腫瘤組織中FAP+成纖維細胞、增殖成纖維細胞和周細胞明顯富集（圖3b、c）。作者又進一步驗證TCGA-COAD隊列中的CRC患者FAP+成纖維細胞在腫瘤組織中的明顯富集（圖3d），同時還觀察到FAP+成纖維細胞浸潤程度較高的CRC患者PFS較短（圖3e）。此外，文章通過流式細胞術(shù)驗證了腫瘤特異性成纖維細胞的浸潤（圖3f、g），結(jié)果表明CRC腫瘤組織中FAP+成纖維細胞浸潤顯著增加，NT5E+和FGFR2+的浸潤顯著減少。

隨后，作者利用scRNA-seq數(shù)據(jù)預(yù)測FAP+成纖維細胞的分化軌跡，該分析預(yù)測腫瘤特異性FAP+成纖維細胞可能來源于FGFR2+成纖維細胞或ICAM1+特絡(luò)細胞（圖3h）。FAP+成纖維細胞的分化是通過復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors, TF）網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的，作者分別評估了這10種MSC亞型top 5表達的TF以及TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中top 5活性的調(diào)節(jié)子（圖3i-l），發(fā)現(xiàn)TWIST1在FAP+成纖維細胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有最高的表達和活性水平，并且可能代表驅(qū)動該分化途徑的主要TF。缺氧是TME最重要的特征之一，之前的研究表明TWIST1可能受缺氧的調(diào)控。與其他MSC亞類相比，缺氧依賴的HIF-1α信號途徑在FAP+成纖維細胞中顯著富集（圖3m）。

圖3. 正常粘膜和腫瘤組織中基質(zhì)細胞的特征

4. 腫瘤特異性SPP1+巨噬細胞與CRC進展相關(guān)

CRC患者髓樣細胞的重塑表明這些細胞在腫瘤發(fā)生中具有功能。作者研究了在腫瘤組織和鄰近正常組織中髓樣細胞亞型的改變（圖4a），單細胞注釋將髓樣細胞分為9種亞類，巨噬細胞和中性粒細胞主要存在于腫瘤組織中，DC在鄰近正常組織中富集。重要的是，SPP1+巨噬細胞是腫瘤特異性巨噬細胞，在腫瘤樣本中占髓樣細胞的11.6%，但在鄰近正常組織中只占髓樣細胞的0.68%（圖4c）。作者又進一步驗證TCGA-COAD隊列中 SPP1+巨噬細胞 浸潤程度較高的CRC患者PFS較短（圖4e）。流式分析結(jié)果表明SPP1+巨噬細胞在腫瘤組織中的浸潤顯著增加，THBS1+巨噬細胞無明顯變化（圖4g）。此外，單細胞 RNA velocity 預(yù)測結(jié)果表明腫瘤特異性SPP1+巨噬細胞可能起源于THBS1+巨噬細胞（圖4h）。

為了進一步確定SPP1+巨噬細胞的主要調(diào)控因子，作者進行pySCENIC分析，結(jié)果表明編碼使小鼠巨噬細胞向M1表型極化的主轉(zhuǎn)錄因子STAT1在SPP1+巨噬細胞中高度活躍（圖4i-l）。由于FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞密切參與缺氧誘導(dǎo)途徑，作者推測在腫瘤的缺氧區(qū)域存在基質(zhì)細胞介導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)連接巨噬細胞和MSC，共同促進CRC微環(huán)境的惡化。

圖4. 正常粘膜和腫瘤組織中髓樣細胞的特征

5. FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的高度浸潤與較差的患者生存率相關(guān)

作者使用CIBERSORTx評估了由scRNA-seq鑒定的50個細胞亞群在14個獨立的CRC隊列中的浸潤狀況（圖5a），發(fā)現(xiàn)FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的相關(guān)性最高。為了進一步揭示這兩種細胞類型之間密切相關(guān)的臨床意義，作者比較了不同水平FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的患者的PFS。FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞均高度浸潤的患者的PFS最短，表明這兩種細胞類型可以協(xié)同促進腫瘤進展（圖5b）。對TCGA-COAD隊列的GSEA分析表明，F(xiàn)AP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞均高度浸潤的腫瘤樣本中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特征和缺氧基因集高度富集（圖5c），TNFα和IL2/STAT5信號通路也出現(xiàn)富集。這些發(fā)現(xiàn)表明FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞對CRC TME中不同的刺激和信號作出反應(yīng)。隨后，作者通過對78例CRC患者組織芯片（TMA）的H-score系統(tǒng)評估蛋白表達水平，與鄰近正常組織相比，腫瘤組織中FAP和SPP1均增加（圖5d，e），F(xiàn)AP或SPP1蛋白表達水平高的患者OS較短（圖5f，g）。此外，F(xiàn)AP和SPP1表達水平均高的患者的存活率較低（圖5h）。免疫熒光標(biāo)記表明CRC組織中SPP1陽性和FAP陽性的細胞空間距離非常接近（圖5I，j），這意味著這兩種細胞之間存在潛在的串?dāng)_。

圖5. FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的高度浸潤與較差的患者生存率以及免疫治療耐藥相關(guān)

6. 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的細胞-細胞相互作用

利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的空間組成進行更深入的評估（圖6a-f），結(jié)果顯示FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞共定位并包裹惡性上皮細胞（圖6g-i），F(xiàn)AP+成纖維細胞或SPP1+巨噬細胞的特征評分呈顯著正相關(guān)（圖6j、k）。此外，作者發(fā)現(xiàn)4例空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集的FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞結(jié)締組織增生結(jié)構(gòu)形成相關(guān)的途徑高度活躍，包括細胞外基質(zhì)組織、膠原纖維組織和對TGF-β的反應(yīng)（圖6l），T細胞和B細胞被排除在腫瘤區(qū)域外（圖6m）。這些結(jié)果表明，促結(jié)締組織增生的微環(huán)境可能受到FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的互作調(diào)控，限制免疫細胞對腫瘤核心的浸潤。

圖6. 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的共定位

7. FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的相互作用可能有助于促結(jié)締組織增生腫瘤微環(huán)境的形成

使用R包“NicheNet”對FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的細胞-細胞間通訊機制進行研究，作者發(fā)現(xiàn)FAP+成纖維細胞通過粘附配體受體對COL1A1/LAMA1-ITGB1與SPP1+巨噬細胞直接聯(lián)系（圖7a）。此外，F(xiàn)AP+成纖維細胞通過表達TGF-β超家族基因、TGFB1和INHBA增強SPP1+巨噬細胞的促炎活性，TGF-β誘導(dǎo)SPP1+巨噬細胞中ACVRL1、ACVR1或ACVR1B的（圖7a）。值得注意的是，F(xiàn)AP+成纖維細胞通過RARRES2-CMKLR1與SPP1+巨噬細胞相互作用（圖7a）。作者進一步確定了RARRES2在MSC群的相對表達，并發(fā)現(xiàn)該基因在FAP+成纖維細胞的表達水平高于其他MSC亞群（圖7b）。由RARRES2編碼的趨化素被證明是一個獨立的CRC風(fēng)險因素，在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，趨化素能夠影響巨噬細胞的極化。編碼趨化素受體的基因CMKLR1在THBS1+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞中的表達水平較高（圖7c）。之前的RNA velocity預(yù)測結(jié)果表明腫瘤特異性SPP1+巨噬細胞可能起源于THBS1+巨噬細胞（圖4h），F(xiàn)AP+成纖維細胞可作為一個驅(qū)動因素，通過趨化素促進SPP1+巨噬細胞的分化。此外，作者發(fā)現(xiàn)CRC患者血漿中的趨化素水平顯著升高，提示趨化素可作為預(yù)測CRC的標(biāo)志（圖7d）。

成纖維細胞是細胞外基質(zhì)成分的主要生產(chǎn)者，細胞外基質(zhì)成分可能有助于促結(jié)締組織增生結(jié)構(gòu)的形成。細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）相關(guān)通路的基因在FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞中高表達，表明FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞可能促進促結(jié)締組織增生結(jié)構(gòu)的形成。因此，作者研究了SPP1+巨噬細胞是否促進FAP+成纖維細胞的ECM重塑能力。NicheNet分析表明，SPP1+巨噬細胞表現(xiàn)出較高的TGFB1、IL1B和IL1A配體活性，TGFB1、IL1B和IL1A基因表達水平相對較高（圖7e，f）。此外，TGFB1編碼蛋白與FAP+成纖維細胞上編碼TGFBR3、ACVRL1和TGFBR1的受體結(jié)合，而編碼IL1B或IL1A的配體與FAP+成纖維細胞上編碼IL1R1或IL1RAP的受體相互作用（圖7g），導(dǎo)致編碼膠原或基質(zhì)金屬肽酶的靶基因在這些細胞中表達（圖7h）。這些靶點是促結(jié)締組織增生反應(yīng)的重要組成部分，其中大部分參與ECM通路（圖7i, j）。綜上所述，研究結(jié)果表明FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞形成相互作用網(wǎng)絡(luò)，支持彼此的維持和功能。這兩種細胞類型可能在ECM重塑中發(fā)揮重要作用，可能促進TME促結(jié)締組織增生區(qū)域的形成。

圖7. FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的互作網(wǎng)絡(luò)

8. FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的高度浸潤與免疫治療耐藥相關(guān)

作者對FAP+成纖維細胞和/或SPP1+巨噬細胞不同浸潤模式的局部免疫特征進行分析，F(xiàn)AP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞浸潤程度高的腫瘤樣本表現(xiàn)出相對較高頻率的非沉默率突變和單核苷酸變異（SNV）預(yù)測的新抗原。此外，也表現(xiàn)出較高的香農(nóng)熵指數(shù)和TCR豐富度，反映了T細胞對新抗原的無效反應(yīng)（圖8a-d）。這種亞型的CRC淋巴細胞浸潤程度最低（圖8e），表明該類型的CRC微環(huán)境特征是免疫排斥型的。使用IMvigor210公共數(shù)據(jù)集對經(jīng)抗PD-L1治療的膀胱癌患者的生存時間與FAP或SPP1表達進行相關(guān)性分析，PD-L1抗體治療后，F(xiàn)AP或SPP1表達水平較高的患者OS較短（圖8f, g），F(xiàn)AP和SPP1表達水平均較高的抗PD-L1治療患者OS較短（圖8h）。FAP或SPP1表達水平較高的患者表現(xiàn)出較低的應(yīng)答和更多的疾病進展（progressive disease, PD），提示FAP或SPP1高表達的患者對抗PD-L1治療的應(yīng)答明顯低于其他患者。

圖8. FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞影響TME中淋巴細胞的浸潤和患者對PD-L1阻斷劑的反應(yīng)

結(jié)語

通過對本研究sc-RNA-seq數(shù)據(jù)、公開發(fā)表的sc-RNA-seq和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集、空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、FACS、IF和ICB治療轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，本文描繪了TME及其鄰近正常組織在單細胞分辨率水平的景觀圖，證明FAP+成纖維細胞與SPP1+巨噬細胞間的相互作用可能在促結(jié)締組織增生TME的形成中起指導(dǎo)作用，這可能導(dǎo)致腫瘤免疫治療的耐藥性。在機制上，作者推測FAP+成纖維細胞受缺氧誘導(dǎo)表達的TWIST1基因調(diào)控；同時還會分泌趨化素，趨化素進入血管并與THBS1+巨噬細胞結(jié)合，后者可能分化為SPP1+巨噬細胞。此外，SPP1+巨噬細胞可能通過TGFB1調(diào)控FAP+成纖維細胞，從而促進MMP和膠原的分泌，共同參與ECM的重塑。

參考文獻：

[1]  Qi J, Sun H, Zhang Y, et al. Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer[J]. Nature communications, 2022, 13(1): 1-20.

撰寫丨wuyan

編輯、排版丨SX

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