編譯：微科盟小木，編輯：微科盟小編、江舜堯。

導讀  

背景和目的：腸道菌群是人體腸道微生物群的重要組成部分，但其在結直腸癌(CRC)中的作用仍不明確。我們進行了一項薈萃分析，以揭示真菌菌群對CRC的貢獻。

方法：本研究從之前發表的7篇文章中檢索了糞便宏基因組數據集，并建立了一個額外的內部隊列，共計1329個宏基因組(454個CRC、350個腺瘤和525個健康受試者)。分析了真菌菌群組成和微生物相互作用。候選CRC富集真菌物種(Aspergillus rambellii)在體外和體內進行了功能驗證。  

結果：多隊列分析顯示CRC患者腸道菌群發生了改變。我們從多個隊列中確定了與CRC和腺瘤患者相關的真菌。標志性CRC相關真菌包括6種富集真菌(Aspergillus rambellii、Cordyceps sp. RAO-2017、Erysiphe pulchra、Moniliophthora perniciosa、Sphaerulina musiva和Phytophthora capsici)和1種減少物種(Aspergillus kawachii)。與腺瘤和健康受試者相比，CRC富集真菌之間的共現相互作用在CRC中變得更強。此外，我們報道了CRC進展過程中腸道真菌和細菌之間的跨界相互作用，其中A. rambellii與CRC富集細菌具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)密切相關。A. rambellii促進體外CRC細胞生長和異種移植小鼠的腫瘤生長。我們進一步發現，真菌和細菌聯合生物標志物比純細菌組更準確地區分CRC患者和健康受試者(AUC相對變化增加1.44%-10.60%)。  

結論：本研究揭示了結直腸腫瘤發生階段的腸道菌群特征和病原真菌。除細菌外，糞便真菌還可用于CRC患者的無創診斷。  

圖文摘要

論文ID

原名：Altered mycobiota signatures and enriched pathogenic Aspergillus rambellii are associated with colorectal cancer based on multi-cohort fecal metagenomic analyses

譯名：基于多隊列糞便宏基因組分析，改變的真菌菌群特征和富集的致病性Aspergillus rambellii與結直腸癌相關

期刊：Gastroenterology

IF：33.883

發表時間：2022.6.18

通訊作者：于君

通訊作者單位：香港中文大學

DOI號：10.1053/j.gastro.2022.06.038

實驗設計

結果

1 共有1329名受試者被納入CRC進展的腸道菌群薈萃分析

在這項薈萃分析中，我們納入了8項已發表的研究，這些研究使用鳥槍法宏基因組學來表征CRC患者與健康受試者的糞便微生物群(表S1和S2)。我們還建立了一個內部糞便宏基因組數據作為額外的研究群體(表S1和S2)。在這些宏基因組中，中位數為0.16%(10 -2.80 )的總宏基因組reads被映射到真菌基因組(圖1A和S表2)，這與之前的研究一致(0.1%)。稀疏曲線顯示，所有隊列樣本在真菌測序reads達到10,000時均達到平臺狀態(圖1B)。為了確保樣品質量，我們采用了一系列嚴格標準的過濾來去除污染或真菌含量低的樣品(圖1C)。Hanningan等人的隊列進行了PCR預處理，并且測序深度較低，因此該數據集被丟棄以避免后續分析中的擴增偏差。過濾后，共保留了1329個宏基因組，包括454名健康受試者(占檢索到的健康宏基因組總數的68%)、350名腺瘤患者(占檢索到的腺瘤宏基因組總數的73%)和525名CRC患者(占檢索到的CRC宏基因組總數的68%)(圖1D)。CRC、腺瘤和健康受試者的丟棄樣本沒有顯著差異，表明我們的樣本均勻分布在不同的研究對象組中。

圖1 宏基因組測序數據及病例篩選標準。(A)左圖：9個隊列(n = 2052)中真菌(紅色邊框)或細菌(藍色邊框)排列計數。右圖：所有樣本中真菌與細菌排列計數的比率(紫色邊框)。(B)基于真菌chao1多樣性生成的微生物群稀疏曲線。(C)病例過濾標準包括3個主要部分：樣本序列質量控制、疑似污染樣本過濾和低真菌序列深度樣本丟棄。總共有723例被丟棄，與之前的研究一致，大約30%的受試者沒有真菌。(D)選擇的(黃色)和丟棄的(深藍色)樣本在檢索到的CRC、腺瘤和健康受試者宏基因組中所占的百分比。丟棄樣本均勻分布在不同的研究對象組中(χ2 =4.03，p = 0.13；卡方檢驗)。

2 腸道菌群在CRC進展中發生改變

首先研究了門水平的真菌組成。在所有隊列中，子囊菌門(Ascomycota)是CRC患者和健康受試者中最普遍的真菌門(圖S1A和S1B)。然后，我們比較了CRC患者和健康受試者之間前5個門的豐度，發現這些門在所有隊列中都沒有一致的豐度變化(圖S1C)。對于真菌豐富度，我們發現將所有隊列組合在一起時，CRC患者的α多樣性(chao1指數)顯著降低，這與之前的報告一致( p <0.05)(圖S1D)。而僅在三個隊列中觀察到α多樣性的顯著差異，表明存在隊列間變異。使用主坐標分析(PCoA)，我們發現各隊列間真菌群落的變化顯著歸因于人群(洲或性別)和疾病階段(CRC、腺瘤或健康)的差異(圖S2)，與之前的研究一致。體重指數(BMI)和腫瘤部位對真菌群落變化沒有顯著影響。總體而言，我們證實了腸道真菌菌群與CRC的關聯。

3 確定CRC和腺瘤中的標志性真菌種類

為了表征CRC相關真菌，將所有CRC患者中相對豐度>0.1%(n=296)的單個真菌豐度與健康受試者進行了比較(表S3)。在FDR<0.1時，我們確定了74種真菌物種，其豐度存在差異，然后在FDR<0.01時，我們將其縮減為入圍的33種(下文稱為真菌核心組)(Wilcoxon秩和檢驗)(圖2A和S表7)。該核心組由與CRC相關的具有不同豐度的物種組成，其中 Aspergillus rambellii 是最豐富的，而 Aspergillus kawachii 最少(圖2B)。每個真菌物種的豐度變化在隊列間差異很大，因此表明存在隊列間差異(圖2C)。我們進一步評估了隊列異質性和潛在混雜因素對單個真菌物種的影響。與我們的PCoA分析(圖S2)一致，隊列異質性比其他因素(年齡、BMI和性別)的影響更大(圖S3)。值得注意的是，與隊列異質性和其他混雜因素相比，疾病階段(CRC、腺瘤或健康)與33個物種的真菌核心組豐度的變化更密切相關，表明疾病階段對物種組成的影響大于隊列間變異。

真菌核心組包括10種CRC富集真菌和23種CRC減少真菌(圖3A)。與健康受試者相比，CRC患者的 A. rambelli 豐度增加3.0倍， A. kawachii 豐度減少2.0倍( p <0.0001)(圖3B)。與健康受試者相比，CRC患者中 A. rambelli 的中位豐度更高，并且這種增加在8個隊列中的7個隊列中持續顯著(圖3C；表S8和S9)。為了確定在不同隊列中一致變化的真菌，我們識別了8個隊列中至少在7個隊列中發生變化的18種真菌(7種CRC富集，11種CRC減少)(表S9)。7種一致的CRC富集真菌分別是 A. rambellii、Erysiphe pulchra、Aspergillus ochraceoroseus、Elsinoe australis、M. perniciosa、Sphaerulina musiva 和 Thielaviopsis punctulata 。11種一致的CRC減少真菌分別為 Trichophyton mentagrophytes 、 olletotrichum fioriniae 、 Colletotrichum salicis 、 Colletotrichum tofieldiae 、 Paracoccidioides brasiliensis 、 Pichia kudriavzevii 、 Pneumocystis murina 、 Pseudocercospora fijiensis 、 Rhizoclosmatium globosum 、 Rhizoctonia solani 和 Spizellomyces punctatus 。此外，在真菌核心組中，從CRC前體、早期CRC到晚期CRC，發現了2種真菌( Cordyceps sp.  RAO-2017 和 Phytopythium vexans )顯著且一致的富集，1種真菌( A. kawachii )減少，表明這些真菌物種在CRC進展中的因果作用(圖S4)。

然后將CRC患者與腺瘤患者的真菌豐度進行比較。FDR<0.01時，在CRC和腺瘤患者之間發現了24種差異豐度真菌(圖S5A和表S10)。在這24種真菌中，觀察到1種CRC富集( A. rambellii )和6種CRC減少的真菌物種( A. kawachii、Fusarium pseudograminearum、Lentinula edodes、Hanseniaspora guilliermondii、Saitoella complicata 和 Cryptococcus neoformans )的豐度變化是腺瘤患者的1.4倍以上(S圖5B)。值得注意的是，當將CRC患者與腺瘤患者和健康受試者進行比較時，7種真菌的豐度發生了一致的改變(表S7和10)，這表明它們是CRC腺瘤相關真菌的標志性物種。這7種真菌包括6種CRC富集真菌( A. rambellii、Cordyceps sp.  RAO-2017、E.pulchra、Moniliophora perniciosa、S. musiva 和 Phytophthora capsici )和1種CRC減少真菌( A. kawachii ) (圖S6)。

我們進一步比較了腺瘤患者和健康受試者之間的真菌豐度。FDP<0.01時，在腺瘤患者和健康受試者之間發現了10種差異豐度真菌(圖S7A)。在這10種真菌中，腺瘤患者中5種真菌的豐度至少增加了1.5倍(圖S7B)。此外，與CRC患者和健康受試者相比，腺瘤患者中的5種真菌(包括 Cryptococcus neoformans 、 Encephalitozoon cuniculi 、 F. pseudograminearum、S. complicata 和 Talaromyces islandicus )發生了顯著改變(表S10和S11)。當CRC患者與健康受試者比較時，這5種真菌未被納入核心組(表S7和S11)，表明這5種真菌僅與腺瘤相關，而與CRC無關。總之，我們的多隊列宏基因組分析揭示了與CRC和腺瘤相關的標志性真菌物種。

圖2 多隊列分析報告了一組與CRC密切相關的腸道真菌。(A)相對豐度<0.1%的296種真菌中，發現了CRC患者和健康受試者之間豐度顯著變化的真菌(n=74，FDR<0.1；n=33，FDR<0.01)。(B)在所有隊列中出現成對倍數變化的真菌核心組(n=33)。紅色和藍色條分別代表CRC富集和減少的真菌物種。倍數變化大于兩倍或小于一半的真菌被突出顯示。(C)每個隊列中具有成對倍數變化的真菌核心組。采用雙側Wilcoxon檢驗，并在每個單獨研究中概括倍數變化。Abs，絕對值；FC，倍數變化。

圖3 CRC患者與健康受試者的特征真菌種類比較。(A)真菌核心組包括10種CRC富集真菌和23種CRC減少真菌物種，其在CRC患者(n=454)、腺瘤患者(n=350)和健康受試者(n=525)之間的豐度存在顯著差異。真菌豐度歸一化為相對于對照樣品豐度中值的自然對數倍數變化。臨床和隊列信息顯示在圖頂部，包括隊列、性別、年齡、腫瘤位置和BMI。(B, C)所有隊列(B)和每個研究(C)中倍數變化最大的兩種真菌A. rambellii(CRC富集)和A. kawachii(CRC減少)的小提琴圖。健康受試者和CRC患者分別用黃色和紅色表示。

4 Aspergillus rambellii在體外和異種移植小鼠模型中促進CRC

為了驗證計算機實驗結果，將兩種CRC細胞系SW480和HT29以及一種正常結腸上皮細胞系NCM460與 A. rambellii ( A.r CM)條件培養基或對照培養基SDB共培養。 A.r CM顯著增加了CRC和正常上皮細胞的活力(SW480和NCM460， p < 0.01；HT29， p < 0.001)(圖4A)。 A.r  CM還顯著促進了腫瘤細胞集落的形成(SW480和HT29， p < 0.001)(圖4B)。然后，我們將兩種源自CRC患者的類器官與 A.r  CM或SDB對照共培養。 A.r  CM處理后，CRC類器官的生長和增殖得到了顯著促進(圖4C)。然后，我們使用植入CRC細胞系SW480的皮下異種移植小鼠模型來評估 A. rambellii 在體內是否具有致癌作用。瘤內注射 A. rambellii 或PBS作為對照，我們發現與PBS對照相比， A. rambellii 顯著促進腫瘤生長( p < 0.05)(圖4D)和腫瘤重量( p < 0.05)(圖4E)。與對照小鼠的腫瘤組織相比， A. rambellii 還顯著促進了腫瘤組織中的細胞增殖，表現為Ki-67陽性細胞比例較高( p < 0.001)(圖4F)和PCNA蛋白水平升高( p < 0.0001)(圖4G)。因此，我們在體外和體內研究的一致結果表明， A. rambellii 可以促進CRC進展。

圖4 Aspergillus rambellii在體外和體內促進結直腸腫瘤的發生。(A) A.r CM(10.0%)促進CRC細胞(SW480, HT29)和正常結腸上皮細胞(NCM460)的活力。以SDB培養基為對照。(B) A.r CM增強了CRC細胞集落的形成。(C)來自CRC患者的類器官(828和816)用A.r CM治療。左圖：A.r CM或SDB處理的類器官培養6天后的代表性圖像(比例尺=100 μm)。右圖：類器官表面積(104 μm2)。(D-G) SW480異種移植小鼠分別用A. rambellii處理或PBS對照。A. rambellii顯著促進腫瘤生長(D)、腫瘤大小和腫瘤重量(E)。(F) Ki67陽性細胞的代表性免疫組化圖像及定量數據分析。放大倍數200×，比例尺=30μm。(G) SW480異種移植物中PCNA蛋白表達水平，用β-actin表達標準化。數據用平均值±標準差表示。A.r和PBS處理分別用紅色和黑色表示。

5 CRC進展中的真菌-真菌和真菌-細菌相互作用

已知微生物之間的相互作用與結直腸腫瘤的發生有關。因此，我們通過與DGCA的相關性分析，評估了CRC、腺瘤和健康受試者中33種核心真菌物種之間的相互作用。真菌之間的共發生和共排斥相互作用在不同的受試者組之間存在顯著差異，這種真菌-真菌相互作用對CRC的影響逐漸增強(圖5A和圖S8)。在CRC中，4種CRC富集真菌(包括 A. rambellii 、 E. pulchra 、 T. punctulata 和 S. musiva )顯示出顯著的共現中心性。而這些共現相關性在腺瘤患者中較弱，在健康受試者中則消失。與CRC相比， A. rambellii 與腺瘤和健康受試者中的其他真菌具有完全不同的相互作用，僅與 M. perniciosa 有很強的相關性。我們的研究結果確定了關鍵真菌(特別是 A. rambellii )，它們在CRC進展過程中的腸道菌群中具有核心作用。

鑒于人類腸道微生物群以細菌為主，我們評估了真菌和細菌之間的相互作用。與健康受試者相比，在CRC中鑒定出31種差異豐度細菌(以下稱為細菌核心組)，包括致病性具核梭桿菌( Fusobacterium nucleatum ) 、Parvimonas micra 和 Gemella morbillorum 的富集，以及益生菌 Roseburia intestinalis、Bifidobacterium bifidum 和 Streptococcus thermophilus 的減少(圖S9和表S12)。然后，我們評估了真菌和細菌之間的跨界相互作用，觀察到從健康受試者(n=143)、腺瘤患者(n=156)到CRC患者(n=184)，真菌-細菌的顯著相互作用數量有所增加(圖S10和表S13)。同樣，真菌-細菌相互作用的強度也隨著CRC的進展而增強(圖5A和圖S10)。共有99種真菌-細菌相互作用，包括 A. rambellii 和 F. nucleatum 之間的相關性，僅在CRC中顯著，而在腺瘤和健康受試者中不顯著(圖5B)。而在CRC和腺瘤中，共有17種真菌-細菌相互作用(包括 A. rambellii 和 P. micra 之間的相關性)均顯著。總體而言，我們揭示了CRC進展中腸道真菌和細菌之間的跨界相互作用。

圖5 CRC進展中的真菌-真菌和真菌-細菌相互作用。(A)左圖：CRC、腺瘤和健康受試者中33種真菌核心組和31種細菌核心組之間的相關性。右圖：不同疾病階段的33種真菌核心組之間的相關性。粉色菱形、藍色圓圈和綠色圓圈分別代表CRC與健康受試者、CRC與腺瘤、腺瘤與健康受試者之間顯著不同的配對相關性。(B)熱圖顯示跨界真菌-細菌相關性與疾病進展的一致增加或減少趨勢。僅顯示一致的相關性。

6 腸道真菌和細菌之間的相互作用與CRC進展相關

通過比較CRC與健康受試者的相關性強度，進一步研究了微生物相互作用是否與CRC進展相關。我們發現真菌-真菌相互作用網絡(z-score=+4)不同于細菌-細菌相互作用網絡(z-score=-2)(圖S11A)。然后定義了CRC與健康受試者之間的9類差異配對相關性(S圖11B)。在健康受試者中觀察到更多正的真菌-真菌差異相關性(占總真菌-真菌差異相關性的30.77%)，隨著CRC的進展而下降。相比之下，CRC中大多數真菌-細菌差異相關性為正(占總真菌-細菌差異相關性的56.72%)，但在健康受試者中不顯著。

為了可視化差異相互作用網絡，使用DGCA并通過相似性傳播簇將具有相似差異相關強度(z-score)的微生物分組在一起。33種真菌和31種細菌的核心組被分成6個簇(圖6)，這6個簇中有2個表現出優勢，分別被命名為Fun_cluster(81.8%的微生物是真菌)和Bac_cluster(81.0%的微生物是細菌)，而這兩個大集群也暗示了CRC進展中真菌-真菌和細菌-細菌相互作用之間的差異。值得注意的是，Fun_cluster中包含了3種成熟的CRC富集細菌，即 F. nucleatum 、 F. periodonticum 和 P. micra ，并顯示出與其他真菌的強差異相關性。例如， A. rambellii 與 F. nucleatum 和 P. micra 的相關z值分別為-5.95和-5.07(表S13)，表明致病菌可能與CRC中的真菌有密切的相互作用。對于Bac_cluster，涉及的大多數微生物是益生菌，如 S. thermophilus 和 Eubacterium eligens 。總之，我們的差異相關分析揭示了CRC進展中真菌和細菌之間的相互作用。

圖6 CRC與健康受試者之間的差異相關網絡。采用差異相關指數(z-score)評估CRC與健康受試者之間微生物相互作用的差異。通過相似性傳播簇將6個集群聚在一起。這兩個主要集群被稱為Fun_cluster和Bac_cluster，因為它們分別主要包括真菌和細菌。Abs(z-score)，z-score絕對值、CorrCRC，CRC患者的相關性；CorrCTRL，健康受試者的相關性；Countscorr、相關數量。

7 結合真菌和細菌的生物標志物組可提高CRC診斷性能

因此，我們評估了腸道真菌是否也可以作為CRC的診斷生物標志物。在33種真菌和31種細菌的核心組中，只有4種在區分所有8個隊列中的CRC患者和健康受試者時的中位AUC大于60%，包括 A. rambellii (圖S12A)和3種細菌( F. nucleatum、P. micra 和 G. morbillorum )(圖S12B)。 P. micra 的診斷準確性最高，中位AUC為67.95%，但這種表現在臨床上被認為不令人滿意。為了提高準確性，我們采用了一種結合了真菌和細菌的生物標志物組。我們用純真菌(n=17)、純細菌(n=12)或兩者混合(5種真菌和9種細菌)對CRC診斷小組進行培訓(圖7A和圖S13)。在兩個隊列(2016_VogtmannE和2019_WirbelJ)中，純真菌組診斷CRC的性能高于純細菌組。然后，我們將來自8個隊列的所有樣本合并在一起，通過隨機森林和5倍交叉驗證，評估生物標志物組的整體性能，以區分CRC患者和健康受試者(圖7B)。真菌與細菌聯合組的AUC達到90.02%，純細菌組的AUC為83.22%。與純細菌組相比，真菌和細菌聯合組的性能得到了很大提高，8個隊列中有5個隊列的AUC達到80%以上(AUC提高了1.44%-10.60%)(圖7C)。真菌和細菌聯合組也可以將早期CRC(AUC=73.85%-89.85%)或晚期CRC患者(AUC=80.76%-90.86%)與健康受試者區分開來(S圖14)。此外，與純細菌組(AUC=82.95%)相比，聯合組可以將CRC與腺瘤患者進行分類(AUC=86.39%)，性能更好(圖S15)。因此，我們的研究結果表明使用真菌和細菌混合標志物的診斷小組比使用純細菌的常規小組更準確地識別CRC患者和健康受試者。還測試了我們的生物標志物組在腺瘤患者中的診斷性能。我們訓練了分類器以使用相同的方法從健康受試者中識別腺瘤患者。純真菌組(n=11)用于鑒別腺瘤患者的平均AUC為57.17%(圖S16A)，將該組與細菌生物標志物相結合可提高其性能(AUC=68.44%；6種真菌和4細菌)(圖S16B-D)。

圖7 結合真菌和細菌物種的生物標志物組提高了CRC診斷性能。(A)上圖：使用內部隨機森林得分估計的每個隊列中每個微生物物種對交叉驗證預測性能的重要性(橙色：真菌；藍色：細菌)。僅包括出現在至少一個數據集中的三個頂級特征中的物種。下圖：8個隊列中真菌、細菌(Bac)和真菌-細菌聯合(Comb) CRC診斷模型的AUC表現，以及細菌和真菌-細菌聯合診斷模型之間的相對變化。(B, C)通過隨機森林對所有樣本進行5倍交叉驗證(B)，或在每個隊列中使用LOSO(C)，將CRC患者與細菌(Bac)和真菌-細菌(Comb)分類器的健康受試者區分開來的診斷性能。

討論

在本研究中，我們檢索了之前7項CRC微生物群研究的宏基因組數據集，并建立了一個額外的內部隊列來揭示CRC中真菌菌群的分布情況。細菌與CRC的關聯已得到廣泛認可，而真菌由于其在腸道微生物群中的豐度相對較低而經常被忽視。這種低豐度極大地影響了對這些真菌的研究，因為單個宏基因組數據集可能沒有足夠的測序reads和樣本量來獲得腸道菌群的全面概況。同時，通過結合可比研究的結果，多隊列分析可以提高統計能力，減少隊列特異性偏差。在本研究中，我們揭示了來自不同人群的CRC患者腸道真菌菌群的改變，我們的結果清楚地表明，CRC進展過程中(從健康受試者、腺瘤患者到CRC患者)真菌生態失調的發生。

然后，我們確定了與CRC不同進展階段相關的標志性真菌物種。特別是，從不同人群中確定了7種與CRC患者一致相關的特征真菌，包括6種富集真菌( A. rambellii 、 Cordyceps  sp. RAO-2017 、 E. pulchra、M. perniciosa、S. musiva 和 P. capsica )和1種減少真菌( A. kawachii )。一些與CRC相關的真菌，如 Aspergillus flavus 、 Kwoniella mangrovensis 和 Pseudogymnoascus sp. VKM F-4518 在我們之前的單一人群研究中被報道過。不同地域人群的腸道微生物群差異很大。事實上，我們發現CRC相關的真菌在人群中是多樣化的。為了識別普遍的CRC相關真菌，我們選擇了在多個人群中不斷改變的物種(如 A. rambellii )。值得注意的是，隊列間變異是微生物薈萃分析中的一種常見現象，因為不同的研究有不同的樣本收集和測序技術方法，而來自不同地理區域的個體腸道微生物群的高度動態特性可能進一步導致生物變異。因此，我們研究了隊列異質性和潛在混雜因素(如年齡、性別、BMI和腫瘤位置)對真菌群落的影響。盡管存在隊列間差異，但我們發現疾病階段(CRC、腺瘤或健康)對物種組成的影響最大(圖S3)，進一步支持了我們發現的普遍的CRC相關真菌獨立于人群差異。

我們的多隊列宏基因組分析共同揭示了整個真菌群落隨著健康受試者-腺瘤-CRC序列中真菌豐度的顯著變化而改變。在我們的33種真菌核心組中，我們發現 A. rambellii 在健康受試者、腺瘤和CRC序列中一致富集， A. kawachii 一致減少(圖3)。為了證實已鑒定的CRC相關真菌的作用，我們進行了功能實驗，以驗證 A. rambellii 的致癌特征，這是CRC患者中最豐富的物種。我們發現 A. rambellii 顯著促進體外癌細胞和體內腫瘤的生長，從而證實了真菌失調在CRC中的潛在因果關系。這些發現得到了先前研究的支持，這些研究表明 A. rambellii 能夠產生多種黃曲霉毒素(如黃曲霉毒素B、黃曲霉毒素G)和黃曲霉毒素前體雜色曲霉素。黃曲霉毒素是真菌衍生的毒素，已被歸類為致癌物和誘變劑 ，其促進肝癌發生的強大能力就是例證。例如，伴有乙型肝炎感染的AFB1長期飲食暴露與肝癌風險顯著增加有關。AFB1因其對免疫系統的毒性作用而聞名，因為它可以通過激活toll樣受體損害人體巨噬細胞和樹突狀細胞，從而誘導免疫失調。雖然曲霉屬( Aspergillus )的其他真菌，尤其是 A. flavus 與癌癥的關聯經常被報道，但在這里我們首次揭示了 A. rambellii 對促進CRC進展至關重要。迄今為止，關于AFB1與CRC相關性的研究很少，因此需要進一步的機制研究來評估 A. rambellii 是否產生AFB1或其他黃曲霉毒素以促進結直腸腫瘤的發生。有趣的是，我們發現另一種曲霉屬真菌 A. kwachii 在CRC患者中顯著減少。這表明同一屬的不同物種可能產生不同甚至相反的效應，從而強調了在物種水平上進行微生物群研究的重要性。此外， C. neoformans 、 E. cuniculi 、 F. pseudograminearum 、 S. complicate 和 T. islandicus 是與腺瘤患者相關的5種標志性真菌。

眾所周知，微生物在人體腸道微生物群中共存，而它們之間的相互作用可能與健康和疾病有關。例如，我們之前的研究報告稱，CRC中共存細菌相關性變得更加普遍。本研究揭示了CRC或腺瘤患者的真菌相關性網絡存在顯著差異。在CRC的相關網絡中，4種CRC富集真菌(包括 A. rambellii 、 E. pulchra 、 T. punctulata 和 S. musiva )顯示出共現中心性。與腺瘤患者和健康受試者相比，CRC中 A. rambellii 和其他真菌之間的相關性發生了很大變化。值得注意的是，我們發現 CRC中整體真菌-真菌相關性降低，而細菌-細菌相關性在CRC進展過程中增強。 這些結果表明，腸道真菌和細菌在CRC中可能存在拮抗作用：健康個體中的真菌相互作用可能會因結直腸腫瘤發生過程中細菌組成的改變而被破壞。細菌-細菌相關性的增加可能會影響腸道真菌群落，從而為致病菌的生長提供有利條件。

然后，我們評估了CRC進展中腸道真菌和細菌之間的跨界相互作用。我們的結果顯示，CRC中大多數真菌-細菌相關性為正相關，但在健康受試者中不顯著。而一些真菌物種與致病菌密切相關，例如 A. rambellii 與公認的CRC相關細菌 F. nucleatum 顯著正相關。以往的研究一致報道了幾種真菌和細菌物種在CRC進展中的共現相關性。人體腸道微生物群由不同界的微生物組成，包括細菌、真菌和病毒，因此可以合理地認為，跨界微生物相互作用在健康和疾病條件下經常發生。我們之前報道了CRC中腸道細菌和病毒之間的跨界相互作用，而在本研究中我們的分析表明真菌和細菌之間的相互作用參與并促進了CRC的進展。值得注意的是，這些發現僅基于宏基因組測序分析，因此需要進行機理研究來驗證結直腸腫瘤發生中的微生物相互作用。

大量研究顯示了使用細菌生物標志物診斷CRC的潛力。本研究證明了糞便樣本中的真菌種類也可以作為生物標志物來識別8個隊列中的CRC患者，平均AUC為73%。而 真菌和細菌混合的生物標志物組在診斷性能上有很大的提高 ，平均AUC為83%。與純細菌生物標志物組相比，8個隊列中有7個隊列的AUC相對變化增加了1.44%-10.60%。測量糞便中的微生物豐度由于其侵襲性低于傳統的結直腸惡性腫瘤內鏡篩查，因此在世界范圍內得到越來越多的認可。然而，在群體水平上識別特征微生物一直具有挑戰性，因為不同人群的腸道微生物群具有高度異質性。此前，Wirbel等人和Thomas等人的薈萃分析報道了幾種CRC富集細菌物種及其作為CRC診斷生物標志物的能力。在本研究中，我們的多隊列分析表明，真菌和細菌生物標志物的聯合使用可以進一步提高診斷性能，從而凸顯了腸道真菌在臨床應用中的潛力。

結論

綜上，我們的薈萃分析闡明了腸道真菌菌群在CRC進展中的重要作用。我們確定了與來自不同人群的CRC和腺瘤患者一致相關的標志性真菌，并揭示了致病性 A. rambellii 在體外和體內顯著促進了CRC的發展。因此，有必要進行進一步的機制研究來表征菌群失調的后果，并評估CRC富集真菌物種是否是CRC的原因。我們的研究結果還強調了真菌作為CRC診斷生物標志物的潛力。有必要對結合真菌和細菌生物標志物的CRC診斷組進行臨床評估，這可能會改善當前基于單一細菌界的生物標志物組的性能。

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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016508522006564