單基因的預后分析，可以這樣做！

結直腸癌是發達國家中最常見的腫瘤之一，盡管治療和診斷有所改善，但患者的死亡率仍然很高，這表明迫切需要新的生物標記物來正確識別需要進行特殊治療的高�；颊摺Ｗ罱难芯勘砻�，端粒蛋白TRF2在結直腸癌中過表達，并通過端粒外功能促進腫瘤形成和發展，TRF2還會調節由VEGF-A介導的血管形成。

背景介紹

今天，小編給大家帶來了結直腸癌中單基因預后分析相關思路，這篇文章于2020年6月發表在《Journal of Experimental &Clinical Cancer Research》期刊上，影響因子7.068，題目為
TRF2 and VEGF-A: an unknown relationshipwith prognostic impact on survival ofcolorectal cancer patients。

數據介紹

癌癥樣本：
研究者收集了2000年1月至2013年12月在意大利羅馬ReginaElena國家癌癥研究所接受手術治療的185名未經選擇的結直腸腺癌患者的腫瘤石蠟樣本。

臨床數據：從醫院的醫療記錄中獲得，包括有關患者的性別和年齡、腫瘤分化、位置、大小、TNM階段、淋巴結(LN)轉移、組織病理學分級和治療的細節。

TCGA數據集：
從cBioPortal中獲取了TCGA患者的基因組/轉錄組數據（結直腸腺癌，TCGA-泛癌數據）。剔除在疾病階段、VEGF-A/TRF2的表達和time-to-event等數據出現缺失的患者。

結果解析

病人樣本的分類

在本研究中，作者分析了在ReginaElena國家癌癥研究所接受手術治療的185名結直腸癌患者的腫瘤樣本，所有病例的臨床和病理特征見表1（Table 1）.

Table 1

為了確定基因變異是否存在，作者對目前已知或者高度懷疑會促進多種腫瘤進展（包括CRC）的50個基因進行了測序（NGS）（Fig.1a)。在185個分析病例中，18例由于技術原因無法分析，1例所有的研究基因均為野生型，18例存在單基因突變，剩余148例都存在多種基因突變（2-7個），這也表示不同的突變基因可以在一個樣本中共存（Fig.1b）。

數據分析表明，最常見的突變會出現在APC、TP53、KRAS、PI3KCa和KDR這五個基因中（Fig.1a），其中APC、TP53、KRAS和PI3KCa與CRC的腫瘤發生相關，而KDR編碼的VEGFR2，作為VEGF-A的主要受體，其突變狀態可能與VEGF-A在CRC患者中的預后作用相關。

在對這五個基因的分析中，
166例患者中有156例發生突變，更準確地說，40例出現了單個基因突變，116例表現出多個基因突變(55例有兩個突變、44例有三個突變、16例有四個突變和1例五個基因全部突變)（Fig.1c）。

對于每一個選定的癌基因，根據其是否存在特定突變，將患者分類為野生型或突變型（Fig.1d），
APC突變率為49.7%，TP53突變率為43.1%，KRAS突變率為47.3%，PI3KCa突變率為33.5%，KDR突變率為36.5%。

Fig.1

TRF2和VEGF-A表達水平的免疫組化研究

185個CRC樣本的TMA切片使用抗TRF2和VEGF-A的抗體進行標記，并根據染色的強度進行評分(Fig.2a，b)。當腫瘤細胞出現核免疫反應時，認為結直腸腺癌
呈
TRF2
陽性。
IHC染色評分分為陰性（0），低（1+），中（2+），高（3+）。
對于VEGF-A，可以檢測到但出現微弱細胞質免疫染色的腫瘤為1+，存在中等強度的完全細胞質免疫染色的腫瘤為2+，表現出明顯而強烈的細胞質免疫染色的腫瘤為3+。

在之后的分析中，評分0-1定義為低表達（L)，評分2-3定義為高表達（H）。
在185個樣本中，121個（65%）CRC樣本表示出TRF2高表達，而71個（39%）CRC樣本表現出VEGF-A
高表
達
（Fig.
2c）。

在64例低TRF2水平的腫瘤中，52例（81%）為VEGF-A低表達，其余12例（19%）為VEGF-A高表達。相反，在121個TRF2高表達的樣本中，62個（51%）為VEGF-A低表達，59個（49%）為VEGF-A高表達。χ2-test證明這兩個特征之間存在顯著關聯（p<0.0001；Fig.2d)

Fig.2

TRF2和VEGF-A相關性的臨床分析

為了確定TRF2和VEGF-A的預后價值，
回顧
性評估了
平均隨訪時長
為66個月的
185例患者
（95%CI 61.8
-71.
15）的
進展/無疾病生存率（P/DFS）
。
用Kaplan-Meier曲線分析時，
關于VEGF-A/TRF2的影響，作者注意到同時表達高水平VEGF-A和TRF2的患者具有較短的P/DFS(Fig.
3a)。

值得注意的是，
four-arms analysis
揭示了一個顯著的關聯（p=0.057），當VEGF-A和TRF2高表達的患者與所有其他生物標志物組合進行比較時，具有非常顯著的意義（Fig.3b；p=0.003)。有趣的是，這些數據在TCGA的621名CRC患者中得到證實，其臨床結果包括PFS和DSS（Fig.3c，d)。

Fig.3

VEGF-A和TRF2均高表達的患者與VEGF-A低表達、TRF2高表達的患者相比，VEGF-A和TRF2均高表達的患者的生存率更低（Fig.4a）
。

當排除StageIV時，結果會更加有顯著，TRF2和VEGF-A本身對DFS沒有影響，它們在同時高表達的腫瘤中才會具有顯著的預后意義
（
F
ig.
4b
）

。

接下來，作者評估了患者的P/DFS值(N=145)是否與給予的治療和結果有關。有趣的是，Kaplan-Meier曲線(
Fig.4c
，d)說明輔助性治療(主要是FOLFOX和5-FU，兩種未被報道影響端粒生物學或血管生成反應的治療方法)對VEGF-A低表達且TRF2高表達的患者的預后產生了有益的影響，但對TRF2和VEGF-A均高表達的患者并無影響，這提示后一組患者可采用常規輔助治療和抗VEGF-A藥物聯合治療。