編譯：微科盟書明，編輯：微科盟湯貝、江舜堯。
導讀
成功的化學預防或化療是通過在惡性腫瘤發生的初始階段靶向呈遞預防藥物或治療藥物來實現的。細菌可以用作抗癌劑，但是利用弱化的病原菌會有毒性或感染的風險。乳酸菌可以安全食用，并且通常對健康有益，因此它們是用于呈遞抗癌藥物的活載體的理想候選者。在這項研究中，我們使用乳酸菌戊糖片球菌開發了一種用于結直腸癌(CRC)治療的有效細菌藥物輸送系統。它配備了由強誘導型啟動子驅動的雙基因盒，編碼治療蛋白P8融合到分泌信號肽和互補系統。在可誘導的CRC細胞來源的異種移植小鼠模型中，相對于對照，我們的合成益生菌顯著減少了腫瘤體積并抑制了腫瘤生長。當口服該合成益生菌時，由AOM/DSS誘導的結腸炎相關CRC小鼠表現出息肉消退并恢復了菌群分類多樣性。此外，合成益生菌調節腸道微生物群并緩解化學誘導的生態失調。相關性分析表明，特定細菌分類群（如Akkermansia和Turicibacter）與生態平衡或生態失調相關，與其他微生物成員存在正或負相關關系。綜上所述，本研究表明，由戊糖片球菌和P8治療蛋白組合的有效且穩定的合成益生菌可以減少CRC并促進再生，以及基于細胞設計生物藥物治療CRC和改善受損微生物群的有效性和可行性。
原名：A synthetic probiotic engineered for colorectal cancer therapy modulates gut microbiota
譯名：一種用于結直腸癌治療的合成益生菌可調節腸道微生物群
期刊：Microbiome
IF：14.650
發表時間：2021.5.26
通訊作者：Jihyun F. Kim ＆ Myung Jun Chung
通訊作者單位：韓國延世大學生命科學與生物技術研究所系統生物學系；韓國京畿道金浦市細胞生物技術研發中心
圖1a描繪了使用P8治療蛋白治療或預防CRC的合成益生菌的設計原理。為了設計具有增強穩定性和功效的抗CRC治療益生菌，我們首先采用了alr營養缺陷型互補系統，該系統可以在沒有抗生素來維持質粒的情況下阻止P8表達載體pCBT24-2的固化。丙氨酸消旋酶是一種5'-磷酸吡哆醛依賴性酶，參與D-丙氨酸(D-Ala)和L-丙氨酸的相互轉化。D-Ala參與細胞壁肽聚糖層的交聯，并且在自然界中以極低的量存在。因此，該成分對于細菌生長必不可少，alr基因的缺失會導致細胞死亡。為了得到D-Ala缺陷型的戊糖片球菌SL4(-7)，該菌株是SL4缺失了7個天然質粒的衍生體，通過擴增alr基因的上下游1 kb的序列，構建了一個缺失alr基因的同源片段，與染色體相應片段進行同源重組，敲除了戊糖片球菌SL4(-7)染色體上的alr基因（圖S1a、b）。由此產生的營養缺陷型突變體既可以在含有D-Ala的培養基中生長，也可以在有表達alr質粒的情況下存活。使用特異性引物驗證alr基因敲除成功，這種alr營養缺陷型菌株結合表達alr基因質粒的合成菌株稱為PP*。為了建立一個有效的P8基因表達系統，選擇了四種參與核心糖酵解途徑的組成型啟動子：丙酮酸激酶(PK)、膽堿ABC轉運蛋白通透酶和底物結合蛋白、葡萄糖激酶和L-乳酸脫氫酶。使用這些啟動子，我們構建了五套雙表達系統，含有兩個契合基因，編碼表達P8蛋白，并在Usp45分泌信號蛋白的N末端相融合。該系統克隆至含有alr基因的質粒載體上(圖1b)。然后我們使用Elisa方法測定了這五套雙表達系統表達P8蛋白的蛋白量情況，驗證了PK-PK啟動子具有最佳的穩定性和生產力(圖1c)。為了進一步排除宿主基因型可能影響P8分泌性能的可能性，我們分別比對了用pCBT24-2(PP-P8)中的PK-PK啟動子系統用于野生型戊糖片球菌SL4(-7)中P8蛋白的表達，和含有alr質粒載體的PK-PK啟動子系統表達Δalr突變體分泌的P8濃度，發現SL4野生型和Δalr突變體之間沒有P8表達量的差異（圖S1d）。圖1. 基于乳酸菌的藥物遞送系統的模塊設計以實現最佳P8生產力。a 描繪具有alr互補系統的合成益生菌PP*-P8預期作用模式的示意圖，alr，丙氨酸消旋酶基因。b 以多種啟動子構建的P8治療蛋白與27個殘基Usp45前導肽融合的雙重表達。GK，葡萄糖激酶；LDH，L-乳酸脫氫酶；PK，丙酮酸激酶；ChoS、膽堿ABC轉運蛋白通透酶和底物結合蛋白。c 使用ELISA定量PP*-P8分泌的P8濃度，表明PK-PK啟動子系統分泌的P8濃度最高。2 PP*-P8在DLD-1異種移植小鼠模型中的抗腫瘤功效為了確定PP*-P8在體內是否具有抗癌活性，我們使用DLD-1異種移植小鼠模型評估了其功效。皮下經DLD-1異種移植的無胸腺BALB/c裸鼠分別經商業化療藥物吉西他濱，PP*或PP*-P8治療（劑量和給藥方案見“方法”），處死前監測腫瘤大小6周，（圖2，表S2和S3）。與吉西他濱或PP*-P8治療組相比，未治療對照組和PP*治療組的腫瘤生長速度要快得多（圖2a）。實驗結束時，對照組的平均腫瘤體積為2680.9±419.7 mm3，PP*組的平均腫瘤體積為2671.1±651.2 mm3，而吉西他濱和PP*-P8治療組的平均腫瘤體積分別為498.6±192.7 mm3和1371±349.8 mm3（圖2a、b；對照與PP*-P8，P=4.9×10-5）。腫瘤重量在對照組中為2.13±0.31 g，在PP*中為2.35±0.32 g，相比之下，吉西他濱中為0.39±0.16 g，PP*-P8中為0.97±0.30 g（圖S2a；對照vs. PP*-P8，P <1×10−6)。與對照組相比，吉西他濱和PP*-P8治療組腫瘤生長的移植率分別為84.1%和50.8%（圖2c；對照與PP*-P8，P=5.3×10−5）。這個結果證明了我們的合成益生菌PP*-P8與抗癌藥類似,可有效抑制腫瘤生長。接下來，我們進一步研究由PP*-P8誘導CRC異種移植物的生長抑制是否是由于細胞周期阻滯。蛋白質印跡分析顯示腫瘤組織中細胞周期調節因子Cyclin B1和Cdk1的表達在經PP*-P8治療后顯著降低（圖2d，圖S2b）。此外，在PP*-P8治療后，抑制CyclinB1/Cdk1的p21表達增加，p53的表達量也有所增加。總體而言，數據表明抗癌治療蛋白P8抑制p53-p21信號通路，導致DLD-1細胞G2期阻滯。
圖2. PP*-P8益生菌在DLD-1異種移植小鼠模型中的抗腫瘤功效。a 每周記錄的DLD-1衍生腫瘤的大小增加。小鼠（n = 10/組）在右后側皮下接種2×106 DLD-1細胞，然后對照組接受0.9%生理鹽水；dFdC組按體重60 mg/kg腹腔注射吉西他濱，每周2次；PP*組進行1×1010 CFU/只的P. pentosaceus alr(pCBT24-2-alr）灌胃，每周5次；PP*-P8組進行1×1010 CFU/只的P. pentosaceus alr(pCBT24-2-PK-p8-PK-p8-alr)灌胃，每周5次；***P < 0.001對照vs. dFdC，對照vs. PP*-P8，dFdC vs. PP*，PP* vs. PP*-P8。b 在DLD-1異種移植后6周從每個治療組中提取腫瘤組織。c 由對照組和試驗組的平均腫瘤重量計算的腫瘤生長抑制率。d 具有對照的PP*和PP*-P8之間細胞周期調節因子表達的相對倍數變化。每個垂直條代表三個重復的算術平均值。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
3 PP*-P8減弱AOM/DSS誘導的結腸炎相關的腫瘤發生使用完善的AOM/DSS(氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉)誘導的結腸炎相關結腸癌小鼠模型來研究合成益生菌PP*-P8的抗癌作用。在整個68天的實驗周期里，第一天，給C57BL/6小鼠腹膜注射AOM，隨后在其飲用水中補加DSS，持續三次。小鼠被分為五組；未處理對照（只經AOM/DSS處理）、五氟尿嘧啶（5-FU）、野生型
P. pentosaceus
SL4組（PP WT）、PP*和PP*-P8治療組（圖3a；劑量和給藥方案見“方法”）。PP WT、PP*和PP*-P8中戊糖片球菌的相對豐度分析表明，種群維持在0.01~0.03%（圖3b）。盡管PP WT中的戊糖片球菌數量在第1階段增加，在隨后的兩個階段直到實驗結束，這三組呈現相似的菌群豐度。在每次DSS給藥前后觀察到平均出血評分的劇烈變化（圖3c；第5天和第10天之間的P=3.12×10−2，第26天和第31天之間的P=6.40×10−7，以及第47天和第52天之間的P=1.90×10−6）。比較各組在DSS給藥后第25、45、68天的出血評分時，與未處理對照組的第45天（P=1.32×10−2)、第68天(P=1.00×10−5)和PP*的第68天(P=3.53×10−4)相比較，PP*-P8組癥狀明顯緩解。（圖3d，表S4和S5）。嚴重出血和肛門周圍出血通常在對照組中很明顯，而PP*-P8只檢測到隱血或輕微出血。圖4a以及附加文件2中的表S4和S5表明，DSS治療對5-FU組和對照組的體重增加有負面影響，而PP*-P8組小鼠的體重持續增加直至實驗結束。Kaplan-Meier生存圖同樣顯示出PP*-P8處理增加了實驗期間AOM/DSS處理小鼠的存活率，無死亡病例發生（圖4b）。值得注意的是，5-FU組的存活率在第1階段大幅降低，與PP*-P8顯著不同（P=0.025）。結腸長度是評估結腸炎癥嚴重程度的標志之一，在動物安樂死后進行測量，結果表明與PP*-P8組相比，三個對照組的結腸長度顯著縮短，這顯示出嚴重的炎癥現象（未處理對照組、PP WT、PP*分別為P<1×10-6，P=2×10-6, P=1.8×10-5）（圖4c、d）。與僅AOM/DSS處理的模型對照的結腸長度相比，PP*-P8的結腸長度接近健康小鼠組的結腸長度，表明PP*-P8治療時阻止了因AOM/DSS處理造成的結腸縮短情況（表S4）。位于中遠端結腸的結節性息肉狀腫瘤的數量分析，PP*-P8治療組低于未處理對照組（P=3.08×10-3）和PP*（P=1.68×10-3）組，而PP WT沒有顯著變化(P=0.3)（圖4e）。我們還檢測了以原始培養體積的1/10重懸的凍干PP*-P8對AOM/DSS小鼠模型中抗癌活性的影響；結果顯示，凍干前后的PP*-P8的息肉數量無顯著差異（圖S3）。總之，來自AOM/DSS誘導的結腸炎相關癌癥模型的這些結果表明，PP*-P8益生菌有效地抑制了結腸炎癥相關的致癌作用和腫瘤的發展。
圖3. AOM/DSS誘導的結腸炎相關結腸癌發生小鼠模型。a AOM和DSS誘導腫瘤的實驗方案。小鼠（每組n=10）在第1天和第5天腹腔注射12.5 mg/kg的AOM；然后給予含有2% w/v DSS的水5天，普通水16天，在68天的治療過程中重復3次。實驗組別：對照組（0.9%生理鹽水，口服），氟尿嘧啶（5-FU；40 mg/kg，腹膜內注射，每周2次），野生型P. pentosaceus （PP WT；1×1010 CFU/只，口服，每周五次），P. pentosaceus alr (pCBT24-2-alr)(PP*；1×1010CFU/只，口服，每周五次)，P. pentosaceusalr (pCBT24-2-PK-p8-PK-p8-alr)(PP*-P8；1×1010CFU/只，口服，每周五次)，糞便取樣時間表用箭頭表示。b 實驗期間PP*-P8種群相對豐度的時間動態，虛線代表DSS治療。c 每5天通過潛血試驗和可見體征評估出血評分。虛線代表DSS治療過程。d 每個階段的最后幾天，第25、45和68天的出血評分比較。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
圖4. PP*-P8對AOM/DSS小鼠模型中一般健康和腫瘤發生的影響。a 每周記錄小鼠體重的變化。b 五個不同治療組小鼠的Kaplan-Meier存活曲線，進行對數秩檢驗以測量統計顯著性。c 息肉的形態學和組織病理學。第68天后測量結腸長度和e息肉數量。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
4 PP*-P8調節腸道微生物群以緩解AOM/DSS引起的生態失調我們進一步探討了合成益生菌PP*-P8對由AOM/DSS誘導結腸炎相關的結腸癌小鼠模型中腸道微生物群的可能影響，C57BL/6小鼠被分為未處理對照組、5-FU、PP WT、PP*和PP*-P8治療組，接受劑量方案和糞便收集(圖3a)。提取糞便中的DNA，對16S rRNA基因的V3-V4區域進行擴增子測序以監測微生物群落結構。使用QIIME2平臺，以99%的序列同一性將處理后的讀數聚類為
ASV
s以計算相對豐度（表S6和S7）。物種豐富度和均勻度分別通過ASVs數量和逆Simpson指數來衡量受到AOM/DSS處理嚴重干擾的微生物多樣性(圖5a)。正如預期的那樣，所有實驗組α多樣性均有所降低，經DSS處理后，ASVs數量均有所下降。直到下次給藥ASVs才部分有所恢復。有趣的是，在實驗結束時，PP*-P8組似乎比5-FU組和對照組在第3階段更好地恢復了分類多樣性（圖5a中的紅線）。基于Bray-Curtis差異性的主坐標分析(PCoA)說明了每個治療組與預處理樣本之間糞便微生物群的差異性在第0天和第5天隨著治療階段的進展而增加（圖S4）。對照、5-FU和PP*-P8處理之間的差異在第1階段不明顯（圖5b，圖S4)。然而，β多樣性隨著時間的推移而增加，微生物變異的置換多變量分析導致第2和第3階段的組之間存在顯著的統計差異（分別為P=0.012和P=0.001）。PCoA圖還顯示，與PP*-P8相比，三個對照組在第2和第3階段變得更加分散。值得注意的是，5-FU和PP*-P8在第3階段出現相似（圖5b）。分析每個階段每個組的微生物分類群的分布和豐度，結果表明擬桿菌門和厚壁菌門中的細菌主導了小鼠腸道微生物群（表S7）。科水平的相對豐度表明，在第0天，
Muribaculaceae
、毛螺菌科、瘤胃球菌科和乳桿菌科是主要的菌群，而在DSS處理期間，阿克曼菌科、擬桿菌科和丹毒絲菌科，以及Muribaculaceae、毛螺菌科、乳桿菌科和瘤胃球菌科(圖5c)。每個科的相對豐度波動取決于DSS處理的階段。與對照相比，在第3階段觀察到顯著不同的
β
多樣性模式（圖5b；P=0.001），5-FU組富含阿克曼菌科和瘤胃球菌科，但缺乏丹毒絲菌科和乳桿菌科。在PP*-P8處理組中，與對照相比，阿克曼菌科和乳桿菌科增加，而丹毒絲菌科細菌減少。來自AOM/DSS小鼠模型的數據表明，PP*-P8益生菌通過調節腸道微生物群結構的α和β多樣性以及潛在有益分類群的比例，有助于緩解AOM/DSS誘導的生態失調。
圖5. PP*-P8處理的AOM/DSS小鼠腸道微生物群的縱向分析。a糞便樣本中微生物群落的α多樣性指數的變化。物種豐富度和均勻度用檢測到的ASVs的數量以及Simpson和Shannon指數來表示。b基于Bray-Curtis相異性的主坐標分析。每個點表示一個樣本，每個組以不同的顏色顯示。P值對應于置換多變量方差分析結果。c科水平的微生物組成以相對豐度顯示。5 PP*-P8維持的生態平衡與特定的細菌分類群相關為了確定哪些細菌最有可能造成治療組之間的差異，當小鼠從最后一次DSS處理中恢復時，我們應用LDA和LEfSe方法計算最后三個樣本在第56天、第63天和68在第3階段的LDA分數。圖6a顯示了屬水平上根據效應大小排序的分類進化枝列表，在具有統計學和生物學意義的組間存在差異。結果顯示，在PP*-P8和對照組之間，Akkermansia、Pediococcus和未分類的Bacteroidales細菌在PP*-P8中最具差異性（log10 LDA≥4.0）。類似地，Akkermansia和Bacteroides在PP*-P8中的差異最大，而Turicibacter和未分類的
Muribaculaceae
細菌在PP*中差異最大。在5-FU和對照組之間，5-FU中最高的菌屬包括Bifidobacterium、一種未分類的Bacteroidales細菌、Ruminococcus 1,和Dubosiella，而對照中最高的是Turicibacter。在PP*-P8和
5-FU
兩組之間，PP*-P8組中，桿菌類別中的Lactobacillus、Pediococcus、以及其他的乳酸菌豐富度最為顯著。5-FU組中以各種級別的放線菌至雙歧桿菌，Coriobacteriia至Coriobacteriaceae UCG-002，和Dubosiella較多（圖S5）。腸道微生物群成員之間的相互作用是使用成對Spearman等級相關系數確定的，該系數在第3階段的第56、63和68天計算，使用20個最豐富的屬用于統計分析，并可視化為熱圖(圖6b)。該圖顯示了兩個相互競爭的集群：一個由Akkermansia、一種未分類的毛螺菌科、毛螺菌科NK4A136組、一種未分類的瘤胃球菌科、雙歧桿菌和Parasutterella組成，另一個由Turicibacter、一種未培養的擬桿菌屬細菌、未分類或未培養的Muribaculaceae成員組成。特定細菌，如Akkermansia和未分類的毛螺菌科，以及Turicibacter和未分類或未培養的Muribaculaceae成員與其他細菌有多種相互作用，因此可以稱為關鍵分類群。Akkermansia是PP*-P8組微生物特征的標志性分類群，與Turicibacter呈高度負相關，Turicibacter是對照組和PP*組的生物標志物，它是一種未培養的Muribaculaceae的成員和一種未分類的Muribaculaceae。另一方面，Akkermansia與毛螺菌科NK4A136、Parasutterella、雙歧桿菌和未分類的毛螺菌科有很強的正相關關系。Turicibacter與毛螺菌科NK4A136、未分類的瘤胃球菌科、Akkermansia和未分類的毛螺菌科呈負相關，與未分類的毛螺科呈正相關。這些結果表明微生物成員之間的正負關系塑造了群落結構。然后，我們探討了特定細菌分類群的α多樣性的可能影響。20個最豐富屬的相對豐度與Shannon指數的關聯用
Spearman
秩相關法進行測定測量的（圖6c）。Turicibacter是唯一與Shannon指數呈顯著負相關的屬（R=-0.74，P=0.0022）。相反，毛螺菌科NK4A136(R=0.82，P=0.00022)和未分類的瘤胃球菌科(R=0.87,P=2.2×10
−16
)呈正相關。基于這些，我們推測由Turicibacter和Muribaculaceae的一些成員組成的集群與生態失調有關，而包括Akkermansia、毛螺菌科的一些成員、未分類的瘤胃球菌科、雙歧桿菌和Parasutterella的集群與恢復生態平衡有關。基于擴增子測序，在第3階段的恢復期周期里，第56天，63天，68天，Akkermansia的平均相對豐度為0.09±0.02%，比PP*組和對照組分別高4.16倍和2.77倍。另一方面，這些天中對照組和PP*組中的Turicibacter分別為0.27±0.2%和0.11±0.03%，它們分別比PP*-P8高8.89倍和3.88倍，分別比5-FU高9.39和4.1倍。為了驗證基于比例分析的結果，我們使用qPCR確定了兩個屬的絕對豐度（圖6d表S4）。PP*-P8中的Akkermansia在第56、63和68天測量數量為4.21±0.82×109、1.17±0.07×109和3.51±0.06×109個細胞/g糞便樣品，比PP*高3.5~4.9倍，比對照高2.74~3.93倍。相反地，在對照組和PP*組中，測得的Turicibacter在這三天的數量分別為1.27±0.02×109、2.08±0.61×109、和1.59±0.22×109，1.75±0.03×109、1.46±0.03×109、和1.14±0.04×109。比PP*-P8組分別高0.99~3倍和0.98~2.11倍，比5-FU組分別高1.45~2.43倍和1.07~1.99倍。這些結果表明Akkermansia和Turicibacter的相對豐度與定量計數一致。為了確定各組在第3階段56、63和68天的功能特征，根據LDA效應大小(log10LDA>2.0)列出了PICRUSt2預測的顯著富集的KEGG通路(圖6e)。與對照相比，PP*-P8中的微生物成員對硫胺素代謝(ko00730)、氯環己烷和氯苯降解(ko00361)、類固醇生物合成(ko00100)和細菌分泌系統(ko03070)有促進作用。在PP*-P8和PP*之間，PP*-P8的富集途徑包括輔因子和維生素代謝(ko00785，ko00730)、糖代謝(ko00630，ko00650)、硒代謝和精氨酸/脯氨酸代謝(ko00450，ko00330)。其中包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(ko00471)，肽聚糖生物合成(ko00550)，蛋白質生物合成(ko00970，ko03010)，以及參與復制和修復的途徑(ko03030，ko03440，ko03410，ko03430)。對比可知，硫胺素代謝是共同的。與對照相比，5-FU預測了18條通路:細菌趨化性(ko02030)、C5支鏈二元酸代謝(ko00660)、6條氨基酸代謝途徑(ko00290、ko00400、ko00340、ko00330、ko00260、ko00270)、4條輔因子和維生素代謝通路(ko00860、ko00770、ko00740、ko00730)。值得注意的是，PP*-P8和5-FU具有共同的硫胺素代謝通路。此外，玉米素生物合成(ko00908)在對照和PP*中重復檢測到。
圖
6.
可能與處理組之間的差異相關的特定微生物分類群。
a
最終
DSS
處理后樣本的線性判別分析效應大小。
b
前
20
個最豐富的細菌類群之間的正相關和負相關矩陣。
顯示了最終
DSS
處理后成對
Spearman
等級相關的結果。
P
值小于
0.05
的相關性用星號標記，
Benjamini-Hochberg FDR
方法調整后的
P
值小于
0.05
用黑色表示。
基于歐氏距離的相關屬被聚類在一起。
紅色，正相關；
藍色，負相關。
未培養
(unc)
或未分類
(una)
屬用其姓氏的首字母標記，
[M]
、
[L]
和
[R]
分別代表
Muribaculaceae
、
Lachnospiraceae
和
Ruminococcaceae
。
c 6
個屬的相對豐度與
Shannon
指數之間的
Spearman
秩相關散點圖。
d
在最終
DSS
處理后第
68
天，通過
qPCR
測量糞便中
Akkermansia
和
Turicibacter
數量。
*P
< 0.05
，
**P
< 0.01
，
***P
< 0.001
。
e
對照與
PP*-P8
、
PP*
與
PP*-P8
以及對照與
5-FU
之間具有豐富的區別性功能通路。如今，伴隨著癌癥機制研究以及診斷、治療手段的進步，癌癥康復率有所增加，但治療中帶來的副反應和耐藥性問題依舊是關注焦點，在癌癥治療的生物制藥手段中，將活細菌用作治療劑的效果已在臨床前或早期臨床試驗中得到驗證；盡管它們仍然存在毒性問題，但它們在遺傳上已減弱至毒性較低甚至無毒的水平。最近，與人體共生的細菌因其抑制或預防CRC的潛力而受到廣泛關注，此前，我們發現了一種源自益生菌LAB菌株的新型治療肽，并使用重組形式證實了其抗CRC功效的臨床潛力。在本研究中，我們采用食品級LAB P. pentosaceusSL4(-7)的D-Ala營養缺陷型突變體，在PK-PK雙啟動子系統的控制下，補充一個含alr的質粒雙基因表達盒，構建了穩定高效的DSS。然后我們將鼠李糖乳桿菌CBT LR5中對DLD-1細胞具有強抗增殖活性的新型治療蛋白P8加載到細菌中，構建用于治療CRC的
PP*-P8
合成益生菌。使用DLD-1異種移植和AOM/DSS誘導的CRC小鼠模型，驗證PP*-P8合成益生菌治療效果。異種移植模型表明，我們的合成益生菌可有效抑制腫瘤生長，并且可以成為具有競爭力的治療菌株。AOM/DSS模型用于縱向評估我們的合成益生菌對致癌作用的抑制作用，與對照組比較分析顯示，PP*-P8組小鼠體重和結腸長度正常，死亡率、出血評分和息肉數量均降低。吉西他濱是一種核苷類似物，已被廣泛用作實體瘤的標準抗癌藥物，并應用于非小細胞肺癌或胰腺癌患者來源的腫瘤移植模型。然而，它在被呈遞到靶位點之前胞苷脫氨酶或脫氧胞苷酸脫氨酶可使其迅速滅活，因此不適合全身治療。因此，我們在DLD-1異種移植模型中通過腹膜內注射吉西他濱進行治療，并在
AOM/DSS
模型中使用了5-FU，這是結直腸癌的一線治療方案化療藥。人們越來越意識到腸道微生物群在影響化療反應和結果方面的作用，化療藥物介導的微生物群的相互影響也越來越受到重視。在我們AOM/DSS實驗時，一個重要發現就是PP*-P8益生菌可調節腸道微生物群結構，以緩解AOM/DSS誘導的從生態平衡到生態失調的變化。多樣性的喪失、變異的增加、組成的不平衡以及特定譜系的變化，無論是有益的還是有害的，都是腸道微生物群不健康狀態的標志。在PP*-P8組中，三種DSS處理后α多樣性的恢復和微生物群落的一致性最為突出，這表明我們的合成益生菌不僅可有效治療CRC，而且有助于維持微生物群結構并可能確保宿主健康利益。在PP*-P8治療的小鼠中測得的體重、存活率和結腸長度增加支持了這一假設。除了抗癌作用外，5-FU治療組的體重迅速下降、生存能力下降和結腸長度縮短與先前研究的病例一致，表明化療的雙面性。組間LEfSe的結果招募了特定的微生物分類群，這些分類群在AOM/DSS模型中的PP*-P8治療期間具有統計學和生物學意義。在確定的分類群中，最引人注目的是Akkermansia-Verrucomicrobia進化枝。Akkermansia muciniphila是眾所周知的健康腸道微生物群生物標志物，被認為是下一代益生菌的有希望的候選者。根據我們的研究，最近的幾項研究報告了該物種對AOM/DSS誘導的炎癥和其他臨床參數的衰減作用。相反，Turicibacter是未處理對照和PP*組的最大特征。盡管對該屬知之甚少，但越來越多的關于它們與疾病關聯的報道證實了我們的結果。Turicibacter sanguinis典型菌株是從一名發熱的急性闌尾炎患者的血培養中分離出來的；此外，據報道，一些Turicibacter細菌具有致病性生活方式，并且通常與宿主伴有炎癥有關。此外，在接受AOM/DSS處理的荷瘤小鼠中大量檢測到Turicibacter，或在患有便秘的日本受試者中顯著富集。根據Spearma的相關分析，Akkermansia和Turicibacter可能形成拮抗簇，由來自LEfSe和Shannon多樣性結果相關的成員組成，因此被確定為關鍵分類群因此，我們預測在AOM/DSS誘導的結腸炎相關癌變發生過程中，PP*-P8益生菌協調微生物群落以維持菌群生態平衡，并可能有助于改善藥物副反應并降低復發率。未來的研究將有必要驗證這些假設。有趣的是，在AOM/DSS模型的第3階段，用PP*-P8或5-FU處理的小鼠的微生物群落是相似的，治療組呈現高水平的Akkermansia和低水平Turicibacter種群。除了它們對癌癥發展具抑制的影響之外，目前尚不清楚這兩種本質上不同的治療如何影響微生物群結構并且彼此相似，它們似乎通過不同的作用機制直接或間接地影響微生物群。事實上，除阿克曼氏菌外，在PP*-P8組中有包括處理過的片球菌在內的乳酸菌，而5-FU中有雙歧桿菌。然而，應該注意的是，在AOM/DSS治療期間施用5-FU對健康有益，因為分子本身會引起多種副作用，包括DNA損傷、炎癥，以及在我們的研究中觀察到的生存能力下降。我們用穩定有效的合成益生菌治療CRC的方法表明了基于細胞的生物藥劑的有效性和可行性。我們的結果也證明了生物藥物和化療藥物對腸道微生物群和對整體健康可能的積極或消極影響。考慮到它們的潛在影響，我們建議在開發治療或預防癌癥（包括CRC）的藥物期間仔細檢查微生物群的動態和相關的健康問題。
