導讀  

放療不可避免地與各種影響癌癥患者生活質量的副作用交織在一起。本研究報道了口腔微生物群的改變可能會影響原發性直腸癌和結直腸癌(CRC)肝轉移的治療療效和預后，這些轉移在病理上破壞了胃腸道的完整性和功能。16S rRNA測序顯示，在CRC小鼠模型中，口腔微生物群的改變會導致腫瘤內的腸道細菌組成發生改變，但不會改變鄰近腫瘤周圍組織的細菌組成。特別是口腔具核梭桿菌 (Fusobacterium nucleatum) 向CRC位點遷移，影響放療的療效和預后。給藥一種特殊的抗生素甲硝唑，消除了口腔微生物組波動對CRC放療的不良影響�？谇痪�群也通過腸道微生物與輻射誘導的腸道損傷相關。我們的研究結果表明，口腔微生物組與其腸道微生物組的協同作用影響CRC放療的療效和預后。

論文ID

原名：Oral microbiota affects the efficacy and prognosis of radiotherapy for colorectal cancer in mouse models 

譯名：口腔微生物群影響結直腸癌小鼠模型的放療療效和預后

期刊：Cell Reports

IF：9.423

發表時間：2021.10.26

通訊作者：崔明＆樊賽軍

通訊作者單位：中國醫學科學院/北京協和醫學院放射醫學研究所

DOI號：10.1016/j.celrep.2021.109886

實驗設計

結果

1 口腔微生物群影響小鼠結直腸癌的發展

為了誘導自發性CRC，小鼠暴露于氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉(AOM/DSS;圖S1A)，然后在特制的籠子中飼養，以避免排泄物微生物組可能因糞養對口腔菌群的影響(圖S1B和S1C)。為了確定口腔微生物群是否影響CRC的進程，根據疾病嚴重程度和病理表現(如體重減輕、直腸出血、糞便不一致)將小鼠分為兩組。與輕癥組相比，嚴重組小鼠結腸較短，腫瘤更多、更大(圖1A-1D)，組織損傷更嚴重(圖1E)。

然后我們比較了不同疾病嚴重程度(輕微和嚴重)的健康正常和患病動物的口腔細菌組成。與健康正常對照相比，輕度疾病動物口腔細菌多樣性增加，病情進展較嚴重的動物口腔細菌多樣性進一步增加(圖S1D-S1H)。β多樣性分析揭示了三個不同隊列之間口腔細菌類群組成的詳細差異(圖1F和1G)。此外，主坐標分析(PCoA)顯示三組口腔菌群明顯分離(圖1H和S1I)。具體來說，與輕癥組小鼠相比，嚴重組小鼠口腔中擬桿菌屬（Bacteroides）、孿生球菌屬（Gemella）和鏈球菌屬（Streptococcus）在屬水平上相對豐度較低(圖1I-1L)，表明口腔微生物群模式可能與CRC的發生有關。

圖 1 在 AOM/DSS 誘導的小鼠模型中，口腔菌群分布與結直腸癌的嚴重程度相關。 (A 和 B) 輕微 或嚴重傷害動物小鼠結腸組織的代表性照片 (A) 和長度定量 (B) 。 顯著性差異： *p ＜ 0.05; 兩組間雙側 Student’s t 檢驗； 每組 n=8 。 (C 和 D) 縱向切開結腸以顯示結直腸內腫瘤數量的宏觀視圖 (C) 和定量 (D) 。 顯著差異： *p ＜ 0.05 ； 兩組間雙側 Student’s t 檢驗； 每組 n=8 。 (E) 用 H&E 染色顯示輕度和重度小鼠結腸的形態； 比例尺， 75 μm 。 (F 和 G) 通過非加權 / 加權 Unifrac 分析比較口腔細菌 β 多樣性。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗； 每組 n=8 。 (H) 采用非加權主坐標分析 (PCoA) 評估口腔細菌分類譜的變化。 顯著性差異： 分子方差分析 (AMOVA) ； 每組 n=8 。 (I) 使用 16S 高通量測序評估正常、輕微和嚴重損傷小鼠口腔細菌屬水平的變化。 熱圖是基于行 Z 得分的顏色。 細菌水平最低和最高的小鼠分別用藍色和紅色表示。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗； 每組 n=8 。 (J-L) 采用 16S 高通量測序法測定口腔樣本中 Bacteroides、Gemella 和 Streptococcus 的相對豐度。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗； 每組 n=8 。 參見圖 S1 和表 S2。

2 口腔微生物組成影響CRC和CRC肝轉移的放療療效和預后

在全腹照射(TAI)后，我們重復進行口腔微生物群移植(OMT) 10天，以改變接受小鼠的口腔微生物群，并檢測OMT對CRC放療療效的影響(圖S1J和S1K)。盡管所有實驗動物最初有相似的口腔微生物群(圖S2A-S2D)，與對照組相比，輻射暴露后第14天，CRC小鼠的α和β多樣性增加。然而，在TAI后，OMT顯著降低了CRC小鼠的α多樣性并提高了β多樣性(圖2A, 2B和S2E-S2I)。未加權PCoAs和加權PCoAs顯示，TAI促進口腔微生物組成的顯著差異，而OMT促進口腔微生物的分離(圖2C和S2J)，表明OMT重組了小鼠口腔微生物組成。例如，OMT降低了輻照后屬水平Bacteroides和Gemella的相對豐度，增加了Streptococcus的相對豐度(圖2d-2G)。

然而，OMT顯著縮短了結腸長度，表明口腔微生物組改變可能對輻射誘導的結腸炎有不利影響(圖2H和2I)。此外，OMT也阻礙了輻照的腫瘤殺傷作用。正如預期的那樣，根據腫瘤數量和大小的減少以及Ki-67(增殖標記物)、血管內皮生長因子(VEGF)(血管生成標記物)和C-X-C趨化因子配體1(CXCL1，一種免疫細胞介質)的相關蛋白水平來判斷，TAI顯著減少了AOM/DSS誘導的腫瘤發生(圖2J-2M)。ELISA檢測顯示，OMT提高了照射后結直腸中促炎細胞因子的產生(圖2N和2O)。由于盆腔和腹腔放射治療經常與不可避免的副作用相關，我們確定了OMT如何影響輻射誘導的胃腸道毒性。OMT顯著加重了輻射誘導的胃腸道毒性，這可以從短的小腸絨毛和稀疏的結腸結構(圖S2K)，促炎細胞因子升高(圖2P和S2L-S2N)，以及小腸上皮完整性受損(圖2Q, S2O和S2P)來判斷。我們的研究結果表明，在CRC的臨床治療中，口腔微生物群的致病成員可能會損害放療的療效。

為了確定口腔菌群組成是否與結直腸癌肝轉移相關，手術將HCT-8細胞注入裸鼠脾臟。如圖2R和2S所示，12 Gy TAI減少了肝轉移灶的腫瘤面積，經OMT治療后，腫瘤面積反而恢復。免疫組化染色進一步證實，OMT加重了放療后CRC肝轉移組織中Ki-67、VEGF和Bcl-2(一種抗凋亡標志物)的蛋白水平(圖2T和2U)，支持口腔病原體對放療后CRC肝轉移的致病影響。

圖 2 OMT 影響 CRC 和 CRC 肝轉移放療的療效。 (A 和 B) 暴露 TAI 14 天后，采用 16S rRNA 高通量測序檢測口腔細菌的非加權 (A) 和加權 (B)Unifrac 分析。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗； 每組 n = 9 。 (C) 用 16S rRNA 高通量測序法檢測 12 Gy TAI 后 14 天小鼠口腔細菌的未加權 PCoA 。 顯著差異： AMOVA ； 每組 n = 9 。 (D) 用 16S rRNA 高通量測序法評估放射第 14 天后，對照組、 TAI 和 TAI+OMT 小鼠口腔細菌屬水平的變化。 熱圖是基于行 Z 得分的顏色。 細菌水平最低和最高的小鼠分別用藍色和紅色表示。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗； 每組 n=9 。 (E-G) 放射第 14 天后，采用 16S 高通量測序法測定口腔樣本中屬水平 Bacteroides 、 Gemella 、 和 Streptococcus 的相對豐度。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗； 每組 n=9 。 (H 和 I) OMT 給藥 14 天后，測量 3 組小鼠結腸組織長度。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ； 兩組間雙側 Student’s t 檢驗； 每組 n=10 。 (J 和 K) 顯示經 OMT 和照射后， CRC 負荷小鼠的腫瘤。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ， ***p ＜ 0.001 ； 兩組間雙側 Student’s t 檢驗； 每組 n=10 。 (L 和 M) CRC 組織中 Ki-67 、 VEGF 、 CXCL1 蛋白免疫染色的代表性圖像和染色強度； 比例尺， 75 μm 。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ， ***p ＜ 0.001 ； 兩組間雙側 Student’s t 檢驗。 (N 和 O) ELISA 法檢測 3 組小鼠結腸組織中白細胞介素 -6 (IL-6) (N) 和腫瘤壞死因子 α (TNF-α) (O) 的表達水平。 顯著性差異： ***p ＜ 0.001 ； 兩組間雙側 Student’s t 檢驗，每組 n=10 。 (P 和 Q) 采用 qRT-PCR 檢測小腸組織中 IL-1 和 Glut1 水平。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ， **p ＜ 0.01 ， ***p ＜ 0.001 ； 兩組間雙側 Student’s t 檢驗，每組 n=10 。 倍數變化與 “Con” 組相關。 (R) HCT-8 細胞注射裸鼠肝臟腫瘤的宏觀圖。 (S) 使用 Image-Pro Plus 軟件測量 (R) 實驗中相對腫瘤面積。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ， **p ＜ 0.01 ， 兩組間雙側 Student’s t 檢驗 ， 每組 n =6 。 倍數變化與 “ Con ” 組相關 。 (T 和 U) CRC 肝轉移組織中 Ki-67 、 VEGF 、 Bcl-2 蛋白免疫染色的代表性圖像和染色強度； 比例尺， 75   μm 。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ， **p ＜ 0.01 ， ***p ＜ 0.001 ； 兩組間雙側 Student’s t 檢驗。 參見圖 S2 和表 S2 。

3 口腔微生物群的變化與腸道微生物群有關

接下來，我們分析了CRC位點和鄰近的非惡性部位(盲腸)的細菌分類學比例，以闡明口腔微生物群對放療效果不利的機制。OMT增加了TAI小鼠CRC位點內細菌的α多樣性(圖S3A和S3E)，但降低了β多樣性(圖3A和3B)。PCoA進一步顯示，OMT通過增加布勞特氏菌屬(Blautia)、Lachnospiraceae_NK4A136_group和鏈球菌(Streptococcus)在屬水平上的相對豐度，形成了CRC位點(圖3C和S3F)的微生物群組成(圖3D-3G)。接下來，我們評估了盲腸的細菌分類比例，發現OMT沒有改變CRC區域外盲腸細菌的α多樣性和β多樣性(圖3H和S3g-S3K)。PCoA圖顯示OMT小鼠盲腸細菌呈交錯分布(圖3I和S3L)，表明盲腸在屬水平上的相對豐度沒有變化(圖3J)。這一證據表明，CRC部位的微生物可能被口腔微生物群改變。

圖 3 在 TAI 后的第 14 天， OMT 改變了 CRC 負荷小鼠腫瘤部位的腸道細菌結構。 “CRC” 代表 CRC 位點的腸道細菌譜，每組 n = 6 。 ‘‘cecum’’ 代表相鄰非惡性部位的腸道細菌譜； 每組 n=6 。 (A 和 B) β 多樣性分析用于檢測 CRC 位點腸道細菌組成的變化。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗。 (C) 使用未加權 PCoA 分析照射第 14 天 CRC 部位腸道細菌組成結構的變化。 顯著差異： AMOVA 。 (D) 應用 16S 高通量測序技術評估照射第 14 天 TAI 和 TAI+OMT 小鼠 CRC 位點腸道細菌屬水平的變化。 熱圖是基于行 Z 得分的顏色。 細菌水平最低和最高的小鼠分別用藍色和紅色表示。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗。 (E-G) 采用 16S 高通量測序法評估照射第 14 天 CRC 位點 Blautia、Lachnospiraceae_NK4A136_group 和 Streptococcus 的相對豐度。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗。 (H) β 多樣性分析用于測量相鄰非惡性部位腸道細菌組成譜的變化。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗。 (I) 用未加權 PCoA 分析在照射第 14 天相鄰非惡性部位腸道細菌組成結構的變化。 顯著性差異： AMOVA 。 (J) 采用 16S 高通量測序法評估照射第 14 天 TAI 和 TAI+OMT 小鼠相鄰非惡性部位腸道菌群屬水平的變化。 熱圖是基于行 Z 得分的顏色。 細菌水平最低和最高的小鼠分別用藍色和紅色表示。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗。 參見圖 S3 和表 S2 。

4 口腔F. nucleatum引起CRC放射抗性

口腔微生物群的改變沒有改變胃腸道的活性氧(ROS)狀態(圖S4A和S4B)，也沒有改變CRC誘導的結直腸致癌基因的表達水平(圖S4C和S4E)，這意味著一些口腔微生物病原體可能會對放療療效產生不利影響�？紤]到梭桿菌屬(Fusobacterium)在結直腸中的致癌作用，我們研究了Fusobacterium是否參與了OMT衍生的CRC放射抗性。因此，我們使用16S rRNA測序分析比較了正常小鼠和AOM/DSS小鼠糞便提取物中梭桿菌的頻率。梭桿菌屬在屬水平上豐度較高(圖S4F)。此外，16S rRNA測序顯示，在OMT處理小鼠的CRC位點的屬水平上，Fusobacterium進一步富集，而在CRC周圍盲腸組織中沒有富集，表明Fusobacterium參與了AOM/DSS誘導的小鼠模型的CRC發生(圖4A和4B)。盡管沒有統計學意義，Flemer等人報道了臨床樣本中CRC患者口腔黏膜中Fusobacterium的含量低于健康對照組。與此同時，嚴重CRC組和OMT治療組、放療抗性CRC組的動物口腔中梭桿菌的頻率相對較低(圖S5A和S5B)。因此，我們在體外培養了具核梭桿菌(F. nucleatum)，并將這種厭氧病原體分布到AOM/DSS誘導的CRC小鼠口腔中。雖然TAI降低了CRC位點的F. nucleatum豐度，但口腔內F. nucleatum的補充也導致了該細菌在CRC位點的富集(圖4C)。雖然F. nucleatum補充沒有改變結腸長度(圖4D和4E)，但F. nucleatum補充劑可能通過促進致瘤組織中的Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白水平的增加(圖4H和4I)，削弱放療的殺瘤作用，并不利地增加了腫瘤的數量和體積(圖4F和4G)。ELISA分析證實，口服F. nucleatum可促進照射后的結腸炎癥(圖4J和S5C)。最后，我們還評估了口服F. nucleatum對放射誘導的胃腸道毒性的影響，結果顯示，口服F. nucleatum的積累加重了腸炎(圖S5D-S5G)，惡化了上皮完整性(圖S5H-S5J)和腸道結構(圖S5K)，表明F. nucleatum影響CRC放療的療效和預后。

通過在脾臟注射HCT-8癌細胞后進行肝轉移實驗，我們進一步評估了F. nucleatum在CRC肝轉移對放療抗性中的致病作用。F. nucleatum給藥顯著提高了轉移性肝組織的轉移負擔，并提高了轉移性肝組織中蛋白水平(Ki-67、VEGF和Bcl-2)(圖4K-4N)，表明F. nucleatum處理阻礙了放療減少腫瘤轉移的療效。

圖4 口腔F. nucleatum (Fn)誘導CRC放射抗性。(A)采用16S rRNA測序法測定CRC位點Fusobacterium的相對豐度。顯著性差異：*p＜0.05；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n=8。倍數變化與“TAI”組相關。(B)采用16S rRNA測序法測定盲腸Fusobacterium的相對豐度。倍數變化與“TAI”組相關。(C) q-PCR檢測小鼠CRC位點F. nucleatum的豐度。顯著性差異：*p＜0.05，***p＜0.001；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n=10。倍數變化與“Con”組相關。(D和E)三組小鼠F. nucleatum給藥14天后測量結腸組織長度；每組n=10。(F和G) 顯示經F. nucleatum處理和照射后CRC負荷小鼠腫瘤。顯著性差異：**p＜0.01，***p＜0.001；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n=10。(H和I)不同組小鼠CRC組織中具有代表性的Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白免疫組化；比例尺，75 μm。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01；兩組間雙側Student’s t檢驗。(J) ELISA法檢測小鼠結腸組織中IL-6的表達水平。顯著性差異：**p＜0.01；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n=10。(K和L) F. nucleatum對照射后HCT-8細胞注射裸鼠肝臟腫瘤發生的影響。顯著性差異：*p＜0.05，***p＜0.001；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n=6。倍數變化與“Con”組相關。(M和N) CRC肝轉移性組織中Ki-67、VEGF、Bcl-2蛋白免疫染色的代表性圖像和染色強度；比例尺，75 μm。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；兩組間雙側Student’s t檢驗。參見圖S4和S5。

5 甲硝唑改善口腔菌群改變引起的CRC放療抗性

為了克服口腔微生物介導的放射抗性，小鼠暴露于甲硝唑(MTZ)，一種Fusobacterium-killing抗生素，以根除胃腸道中的Fusobacterium。首先，我們將F. nucleatum菌株添加到AOM/DSS處理小鼠的口腔中。與F. nucleatum處理組相比，MTZ給藥可恢復F. nucleatum誘導的結腸損傷(圖5A和5B)，并顯著降低照射后的腫瘤數量和體積(圖5C和5D)以及相關蛋白水平(Ki-67、VEGF、CXCL1)(圖5E和5F)。重要的是，MTZ治療導致口腔和CRC部位F. nucleatum的相對豐度降低(圖5G和5H)。

其次，我們采用OMT進一步評估MTZ對結直腸癌的放射增敏作用。正如預期的那樣，MTZ治療減輕了TAI小鼠的結腸炎(圖5I和5J)和結腸損傷(圖S6A)。重要的是，口服MTZ可以抑制由口腔微生物群失衡引起的CRC放射抗性，并顯著降低腫瘤大小(圖5K和5L)和Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白水平(圖5M和5N)。MTZ治療還能保護口腔菌群變化導致加重胃腸道毒性，同時減少炎癥(圖S6B-S6E)，改善上皮細胞(圖S6F-S6H)和腸道完整性(圖S6A)。MTZ處理后第14天，兩組腸道細菌多樣性差異顯著(圖S6I-S6L)。雖然非加權和加權Unifrac分析沒有描述腸道菌群組成的顯著變化(圖5O和S6M)，但非加權和加權的PCoA圖表明，在MTZ給藥后，TAI小鼠的腸道菌群組成明顯分離，口腔菌群發生改變(圖5P和S6N)，這表明MTZ可能塑造了細菌的組成。具體來說，口服MTZ降低了口腔和CRC位點Fusobacterium在屬水平的相對豐度(圖5Q和5R)。熱圖分析進一步表明，MTZ處理導致輻照小鼠OMT給藥后，Blautia和Odoribacter在屬水平上的相對豐度降低(圖5S)。重要的是，我們分析了其他CRC+細菌的變化，16S rRNA測序顯示，無論有無MTZ處理，CRC位點卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)和嗜膽菌屬(Bilophila)的相對豐度都非常低且沒有變化，表明這兩種細菌在該系統中沒有發揮重要作用(圖S6O和S6P)。此外，MTZ給藥后Bacteroides的頻率增加，說明細菌與MTZ誘導的輻射敏感性無關(圖S6Q)。綜上所述，這些結果表明口服MTZ改變了口腔菌群移植介導的腸道細菌結構的變化。由于Fusobacterium促進自噬，我們評估了小鼠結腸LC3I和LC3II的表達水平。如圖5T所示，OMT提高了LC3-II:I的表達比例，MTZ治療消除了LC3-II:I的表達比例，進一步表明Fusobacterium可能參與了口腔微生物群介導的CRC放療抗性。

圖5 MTZ可改善OMT治療CRC的不良療效。(A、B)兩組小鼠結腸解剖照片及長度。顯著性差異：*p＜0.05；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n=10。(C和D)不同條件下CRC負荷小鼠腫瘤情況。顯著性差異：*p＜0.05；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n=10。(E和F)不同組小鼠CRC組織中Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白免疫組化；比例尺，75 μm。顯著性差異：**p＜0.01，***p＜0.001；兩組間雙側Student’s t檢驗。(G和H)用q-PCR方法檢測TAI+Fn組和TAI+Fn+MTZ組口腔樣本及CRC位點F. nucleatum的相對豐度。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n=10。倍數變化與“TAI + Fn”組有關。(I和J) 4組小鼠解剖結腸照片和定量數據。顯著性差異：*p＜0.05；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n=10。(K和L)不同條件下CRC負荷小鼠的腫瘤。顯著性差異：***p＜0.001；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n=10。(M和N)不同組小鼠結腸Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白免疫組化；比例尺，75 μm。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01；兩組間雙側Student’s t檢驗。(O)采用非加權Unifrac比較腸道細菌β多樣性。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗；每組n = 8�！癲ay 14”為MTZ治療小鼠14天。(P) 未加權PCoA分析MTZ處理第14天結直腸癌部位腸道細菌組成結構的變化。顯著性差異：AMOVA，每組n = 8�！癲ay 14”為MTZ治療小鼠14天。(Q和R)通過16S rRNA測序檢測口腔樣本(Q)和CRC位點(R)中Fusobacterium屬水平的相對豐度。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n = 8�！癲ay 14”為MTZ治療小鼠14天。倍數變化與“TAI+OMT d14”組相關。(S)采用16S高通量測序法評估各組腸道菌群屬水平的變化，每組n=8。熱圖是基于行Z得分的顏色。細菌水平最低和最高的小鼠分別用藍色和紅色表示。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗，每組n=8。“day 14”為MTZ治療小鼠14天。(T)采用ELISA法檢測小鼠結腸LC3II/I水平。顯著性差異：***p＜0.001；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n=12。參見圖S6和表S2。

6 口腔微生物群操縱輻射引起的腸道損傷

由于小腸是放射治療期間的主要損傷部位，我們在沒有AOM/DSS暴露的情況下研究了口腔微生物群對輻射引起的腸道損傷的影響。小鼠暴露于腹部局部照射，以模擬有或沒有OMT的放療過程。如圖6A所示，經口腔微生物組操作的小鼠體重損失最大，顯著加重了TAI誘導的腸絨毛損傷(圖6B-6D)。此外，口腔微生物的改變增強了輻射誘導的腸炎(圖6E-6H)，并下調了輻照小鼠小腸中Glut1、MDR1和Pgk1的表達(圖6I-6K)，這表明口腔微生物的結構有助于輻射介導的腸道和上皮損傷。我們的觀察表明，口腔菌群與輻射引起的腸道損傷有關。

圖6 OMT與照射后不良預后相關。(A) 12 Gy TAI后測量3組小鼠的體重(g)。顯著性差異：*p＜0.05，***p＜0.001；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n = 12。(B和C) 3組小鼠解剖結腸照片及定量數據。顯著性差異：*p＜0.05，***p＜0.001；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n = 12。(D) H&E染色顯示小鼠小腸形態；比例尺，75 μm。(E-H)采用qRT-PCR檢測各組小鼠小腸組織中IL-1 (E)、IL-6 (F)、TNF-α (G)、IL-10 (H)的表達水平。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n = 12。倍數變化與“Con”組相關。(I-K) qRT-PCR檢測小鼠小腸組織中Glut1 (I)、MDR1 (J)和Pgk1 (K)基因的表達。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；兩組間雙側Student’s t檢驗，每組n = 12。倍數變化與“Con”組相關。

7 口腔-腸道菌群相互關系干擾放射誘導的腸道損傷

接下來，我們分析了在特制的籠子中飼養的小鼠的口腔細菌分類比例。TAI降低了α多樣性，導致未加權PCoA對口腔微生物的顯著分離(圖S7A-S7J)，表明TAI可能會輕微波動口腔細菌組成。雖然口腔菌群的α多樣性沒有顯示出顯著的變化(圖S7K-S7M)，但非加權Unifrac分析顯示OMT給藥后β多樣性顯著增加，非加權PCoA驗證了口腔菌群的變化(圖7A和7B)，表明OMT確實改變了TAI暴露小鼠的口腔微生物群。具體來說，熱圖和MetaStat分析顯示，OMT給藥后，輻照小鼠口腔中Lachnoclostridium和阿克曼氏菌(Akkermansia)在屬水平的相對豐度下降(圖7C-7E)。

最后，我們比較了含有不同口腔菌群的輻照小鼠的腸道菌群。TAI降低了腸道細菌的豐度，而OMT消除了TAI在某些腸道細菌中引起的這種減少(圖S7N-S7P)。此外，非加權Unifrac分析表明，TAI增加了腸道細菌的β多樣性，而OMT再次減弱了β多樣性(圖7F)。非加權PCoA進一步驗證了TAI型腸道細菌模式通過口腔菌群改變重塑(圖7G)。有趣的是，熱圖和MetaStat分析進一步表明，OMT處理后糞便樣本中Lachnoclostridium在屬水平上的相對豐度升高，Akkermansia在屬水平上的相對豐度降低(圖7H-7J)，表明口腔微生物可能遷移和轉移到下消化道。我們的觀察表明，口腔-腸道菌群軸有助于輻射誘導胃腸道損傷的預后。

圖7 OMT改變照射后腸道細菌群落結構。(A) β多樣性分析用于測量照射后0天和14天OMT小鼠口腔細菌組成的變化。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗；每組n = 8。(B)采用非加權PCoA評估TAI + OMT組口腔細菌分類譜在第0天和第14天的變化。顯著性差異：AMOVA；每組n = 8。(C)采用16S高通量測序技術評估OMT照射后第0和14天小鼠口腔細菌屬水平的改變。細菌水平最低和最高的小鼠分別用藍色和紅色表示。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗；每組n = 8。(D和E)用16S rRNA測序法測定口腔樣本中Lachnoclostridium和Akkermansia屬水平的相對豐度。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗；每組n = 8。(F) TAI暴露14天后，采用16S rRNA高通量測序檢測小鼠腸道細菌的非加權Unifrac分析。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗；每組n = 8。(G)采用16S rRNA高通量測序法檢測小鼠12 Gy TAI后第14天腸道細菌非加權PCoA。顯著性差異：AMOVA；每組n = 8。(H)在TAI暴露后的第14天，用16S rRNA高通量測序法測定小鼠腸道細菌屬水平的變化。熱圖是基于行Z得分的顏色。細菌水平最低和最高的小鼠分別用藍色和紅色表示。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗；每組n = 8。(I和J)采用16S rRNA測序法測定糞便樣本中Lachnoclostridium和Akkermansia屬水平的相對豐度。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗；每組n = 8。參見圖S7和表S2。  

討論

放射治療是治療局部實體腫瘤的最有效的細胞毒性治療方法，在治療過程中接受放射治療的癌癥患者將達到一半。放療是手術根除前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤的主要輔助治療方法，也是頭頸部、肺癌、膀胱癌等腫瘤的首選局部治療方法。CRC占全球每年癌癥相關發病率和死亡率的10%。放療、化療和手術切除通�？梢月摵鲜褂茫�以對抗CRC和相關轉移，因為放療通�？梢越档褪中g切除腫瘤前的局部復發風險。然而，放療往往與各種不良副作用相關，如胃腸道毒性，包括腹瀉、腸炎和吸收不良，不可避免地損害了癌癥患者的生活質量。因此，重要的是制定策略來提高治療效果，同時減少放射治療的相關副作用。以往的研究表明，腸道菌群可能參與了CRC的發生和轉移，但其口腔對等物，口腔菌群在CRC中的作用一直被忽視。因此，我們提供令人信服的證據支持這一概念，CRC的狀態受口腔細菌群落的影響，而細菌群落的操縱可能會影響CRC組織對輻照的敏感性，這提出了口腔衛生在與CRC和相關疾病斗爭中的重要性的重要問題。

人類消化道是共生菌群的家園。從口腔到直腸，大量的微生物寄居在宿主體內，與宿主相互作用，維持新陳代謝、免疫和內分泌功能的穩態�？谇晃⑸�物群是口腔的重要組成部分，在防止可能影響全身健康的外部細菌定植方面起著重要作用。越來越多的證據表明，多種因素，如宿主免疫能力、飲食和環境影響，共同形成了互利的口腔微生物-宿主改變。我們和其他人之前的研究已經證明腹部照射會對小鼠的腸道菌群產生不利影響。在本研究中我們報告了全腹照射后口腔微生物群的變化，并揭示了一種口腔微生物病原體在結直腸癌中的致病作用。我們的發現與以往的觀點一致，即口腔微生物群與多種口腔疾病有關，如齲齒、牙周病、口腔癌和低消化系統疾病，包括CRC、肝癌、胰腺癌和炎癥性腸病(IBD)。現在看來，口腔微生物群可以入侵和定殖消化道的任何部分，損害宿主的健康。通過人工操作口腔菌群，我們證明了口腔微生物組可能能夠驅動下消化道細菌分類比例的波動，在那里這些病原體損害放射治療CRC和CRC肝轉移的療效。因此，口腔衛生培訓和管理可能有助于在臨床環境中對抗CRC和相關疾病。

具核梭桿菌(F. nucleatum)是口腔中最常見的菌種之一，與口腔炎癥相關，包括牙周炎和牙齦炎。在與CRC相關的微生物中，F. nucleatum因其在CRC組織中過多而備受關注。有研究表明，F. nucleatum通過梭桿菌外膜蛋白A (FomA)、梭桿菌粘附素A (FadA)和梭桿菌自身轉運蛋白2 (Fap2)等毒力因子粘附于內皮細胞和上皮細胞，支持在CRC中口腔F. nucleatum的致病作用。在本研究中，我們證實了在AOM/DSS小鼠的糞便顆粒中，Fusobacterium的豐度顯著升高。此外，我們還發現口腔菌群改變會降低放療療效，并促進結直腸癌部位Fusobacterium的富集，這意味著Fusobacterium可能起源于口腔菌群，并在腸道中富集。MTZ對脆弱擬桿菌(B. fragilis)、Clostridium spp.、Fusobacterium spp.和Bacteroides spp.等專性厭氧菌具有良好的活性，是治療口腔結腸炎和感染的理想選擇。放療聯合MTZ治療的CRC小鼠總腫瘤負荷和放射性腸炎均降低。重要的是，MTZ處理降低了CRC部位F. nucleatum的相對豐度。既往研究表明，Fusobacterium部分通過刺激自噬促進CRC放療抗性。在本研究中，我們證實口服補充Fusobacterium可導致輻照小鼠結腸中LC3-I向LC3-II轉化的升高，而這種轉化被MTZ等抗生素的共同給藥所消除。我們的實驗證實，口腔F. nucleatum可能會遷移并定位在CRC位點，從而導致CRC的放射抗性。我們的研究表明，口腔微生物群干擾放療治療CRC和相關肝轉移的療效。表現出不同嚴重程度CRC的動物有不同的口腔細菌模式�？谇晃⑸�物群移植可改變結直腸癌部位的細菌群落，但對瘤周微環境無影響。可見，F. nucleatum可在結直腸癌部位遷移和定殖，從而逐漸形成對放療的抗性，但可通過聯合給藥(如MTZ)而被阻斷。總的來說，我們的發現為口腔微生物群在損害放療中的致病作用提供了見解，并鞏固了口腔-腸道菌群軸緊密相互作用的重要性。在臨床上，結合良好的口腔衛生習慣和適當的抗生素使用，口腔F. nucleatum可作為一種潛在的生物標志物和靶點用于CRC的診斷和治療。

本研究的局限性：本研究的局限性在于輻照的技術處理，不能準確定位原發性直腸癌和結直腸癌肝轉移部位。本研究的另一個局限性是缺乏臨床CRC樣本來驗證小鼠模型的實驗結果。