編譯：微科盟索亞，編輯：微科盟索亞、江舜堯。

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導讀   2022年2月27日，浙江大學醫學院陳淑潔，姒健敏，卓巍團隊等人在Gut Microbes發表題為《Fusobacterium nucleatum promotes colorectal cancer cells adhesion to endothelial cells and facilitates extravasation and metastasis by inducing ALPK1/NF-κB/ICAM1 axis》的文章。腫瘤細胞轉移是結直腸癌(CRC)患者死亡的主要原因，擴散的腫瘤細胞與內皮細胞的粘附是其外滲和進一步轉移的關鍵步驟。前人的研究表明了腸道微生物群-宿主相互作用在CRC惡性腫瘤中的重要作用，據報道，具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)可增加CRC細胞的增殖和侵襲活性。然而，具核梭桿菌在CRC細胞和內皮細胞之間的相互作用以及隨后的外滲中的潛在功能和潛在機制仍不清楚。在本研究中，我們發現具核梭桿菌可以通過誘導ICAM1的表達增強了CRC細胞與內皮細胞的粘附，促進了腫瘤細胞的外滲和轉移。從機制上來看，我們發現具核梭桿菌誘導一種新的模式——識別受體ALPK1激活NF-κB通路，導致ICAM1上調。有趣的是，CRC患者腫瘤組織中具核梭桿菌的豐富度與ALPK1和ICAM1的表達水平呈顯著正相關。此外，ALPK1或ICAM1的高表達水平與CRC患者較短的存活時間顯著相關。這項研究為腸道微生物群在參與CRC細胞進一步轉移中的作用提供了新的見解。   關鍵詞：腸道微生物，黏附，ICAM1，ALPK1，結直腸癌轉移    

論文ID

原名：Fusobacterium nucleatum promotes colorectal cancer cells adhesion to endothelial cells and facilitates extravasation and metastasis by inducing ALPK1/NF-κB/ICAM1 axis

譯名：具核梭桿菌通過誘導ALPK1/NF-κB/ICAM1軸促進結直腸癌細胞與內皮細胞的粘附及其外滲和轉移

期刊：Gut Microbes

IF：10.245

發表時間：2022.02.27

通訊作者：陳淑潔，姒健敏，卓巍

通訊作者單位：浙江大學醫學院

DOI號：10.1080/19490976.2022.2038852

實驗設計

實驗材料：結直腸癌細胞系（LoVo，HCT116）和人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）；F. nucleatum strain 25586和10953，A. muciniphila BAA-835，B.adolescentis strain 15703。收集98對CRC患者新鮮腫瘤和相鄰非腫瘤組織；采集72例CRC患者和66例健康人糞便樣本。構建人源性組織異種移植（patient-derived xenografts，PDX）模型。進行細胞培養粘附和轉移試驗，小鼠試驗，宏基因組分析，轉錄組分析，RT-PCR，免疫組織化學和免疫印跡分析，免疫熒光和共聚焦顯微鏡。探究具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）促進結直腸癌細胞與內皮細胞的粘附及外滲和轉移的機制。

結果

1 具核梭桿菌通過上調ICAM1促進CRC細胞與內皮細胞的粘附與外滲

在我們研究腸道微生物群在CRC惡性腫瘤細胞中的作用時，培養CRC細胞的過程中發現了一個有趣的現象，與大腸桿菌（Escherichia coli）或磷酸鹽緩沖鹽（PBS）對照相比，具核梭桿菌處理可以提高CRC細胞與細胞的相互作用能力。眾所周知，擴散的腫瘤細胞粘附到內皮細胞是其外滲和進一步轉移的關鍵步驟。具核梭桿菌誘導的CRC細胞粘附能力可能促進其與內皮細胞的相互作用和外滲。為了驗證我們的假設，我們設計了一個腫瘤細胞-內皮細胞相互作用模型。將人臍靜脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）移植于培養板中直至完全融合。然后將用具核梭桿菌（具核梭桿菌 strain 25586）、大腸桿菌或PBS對照處理的帶GFP標記的HCT116細胞添加到HUVEC單層中。15分鐘后將未結合的腫瘤細胞沖洗干凈，分析粘附的HCT116細胞（圖1a）。與大腸桿菌處理或PBS對照相比，具核梭桿菌處理顯著增強了HCT116細胞對HUVEC的粘附（圖1b）。同時，與我們之前的研究結果一致，具核梭桿菌處理顯著促進了HCT116細胞（圖1c）和人結腸癌細胞（LoVo）細胞（補充圖1a）的細胞遷移。此外，我們還使用另一個具核梭桿菌菌株（具核梭桿菌 strain 10953）來評估具核梭桿菌的一般特性。結果發現，具核梭桿菌10953處理，與具核梭桿菌25586相似，可以顯著促進CRC細胞與內皮細胞粘附和CRC細胞遷移（補充圖1b-c），表明這可能是具核梭桿菌的一般特性。有趣的是，當我們使用革蘭氏陰性細菌Akkermansia muciniphila （A. muciniphila）和革蘭氏陽性細菌Bifidobacterium adolescentis （B. adolescentis）來鑒定具核梭桿菌的特定表型時，我們發現具核梭桿菌處理顯著促進CRC細胞與內皮細胞的粘附以及遷移能力，但對A. muciniphila或B. adolescentis沒有效果（補充圖1d-e）。

為了證實在體外實驗結果，我們將具核梭桿菌處理的帶GFP標記的HCT116細胞通過靜脈注射到SCID小鼠中。24小時后用PBS灌注肺血管，并分析在肺中的定植HCT116細胞（圖1d）。與大腸桿菌或PBS處理相比，具核梭桿菌處理顯著增加了HCT116細胞的跨內皮細胞的侵襲和定植（圖1e）。為了探究具核梭桿菌誘導的CRC細胞與細胞間粘附能力的潛在機制，我們在有或沒有具核梭桿菌處理（GSE171611）的HCT116細胞中進行了RNA測序。如圖1f所示，在具核梭桿菌處理上調基因中（log2倍數變化 > 1，p.adj < 0.05）、細胞與細胞粘附的GO、細胞粘附的KEGG途徑之間重疊的ICAM1基因。為了證實我們的分析結果，我們檢測了具核梭桿菌處理的CRC細胞中ICAM1的蛋白質表達，并觀察到ICAM1在具核梭桿菌處理的HCT116細胞和LoVo細胞中確實顯著增加（圖1g）。更重要的是，我們用從CRC患者產生的腫瘤組織建立了人源性組織異種移植（patient-derived xenografts，PDX）模型。3名接受具核梭桿菌體外治療的PDX腫瘤組織均顯示ICAM1水平顯著上調（圖1h）。

圖1. 具核梭桿菌促進CRC細胞與內皮細胞的粘附，并通過上調ICAM1促進外滲。（a）體外粘附試驗的示意圖；（b）對用具核梭桿菌、大腸桿菌或PBS對照處理 6小時的GFP標記的HCT116細胞進行粘附試驗；顯示了具有代表性的圖像（左），并通過在五個視野（右）中計數來量數量，比例尺100 μm；（c）HCT116細胞用具核梭桿菌、大腸桿菌或PBS對照處理6小時并進行遷移測定；遷移的細胞在18小時后通過在五個視野中計數進行量化，比例尺，100 μm；（d）體內癌細胞外滲模型的示意圖；（e）通過免疫熒光測定對小鼠肺組織中定植的帶GFP標記的HCT116細胞進行定量，其中肺切片用血管內皮細胞CD31（紅色）的標記物染色，細胞核用DAPI（藍色）復染，比例尺100 μm；（f）采用Venn圖分析256個在RNA測序中mRNA表達顯著上調的基因（倍數變化 > 2，p. adj < 0.05 ）、880個在細胞與細胞粘附GO（GO：0098609）的基因和133個在細胞黏附分子KEGG通路中具有關鍵功能的基因（hsa04514）；（g）通過蛋白質印跡分析以檢測用具核梭桿菌、大腸桿菌或PBS對照處理的HCT116細胞和LoVo細胞中ICAM1的蛋白水平；（h）用具核梭桿菌或PBS對照處理的PDX腫瘤組織中ICAM1的定量RT-PCR分析；數據顯示為平均值±SD，** P< 0.01, *** P < 0.001, **** P< 0.0001。

2  ICAM1參與具核梭桿菌誘導的CRC細胞與內皮細胞的粘附和遷移

為了進一步了解ICAM1在CRC發展中的功能，我們使用兩種特異性siRNA使HCT116細胞中的ICAM1沉默（圖2a-b）。下調的ICAM1顯著抑制了HCT116細胞與HUVEC的粘附（圖2c）。同時，如圖2d所示，ICAM1沉默顯示出顯著的腫瘤遷移抑制作用。同樣，在LoVo細胞中也觀察到了類似的結果（補充圖2a-c）。為了進一步確定具核梭桿菌是否以ICAM1依賴性的方式發揮致癌功能，我們在CRC細胞中進行了ICAM1功能喪失測定。當我們在HCT116細胞（圖2e-f）和LoVo細胞（補充圖2d-e）中沉默ICAM1時，具核梭桿菌處理的CRC細胞中ICAM1的上調mRNA和蛋白質水平顯著降低。正如預期的那樣，ICAM1下調消除了具核梭桿菌介導的HCT116細胞與內皮細胞粘附的促進作用（圖2g）。此外，ICAM1的沉默顯著逆轉了具核梭桿菌誘導的細胞遷移能力增加（圖2h，補充圖2f），這表明了ICAM1在維持由具核梭桿菌介導的腫瘤細胞功能中發揮了重要的作用。綜上所述，我們認為ICAM1參與了CRC細胞與內皮細胞的粘附和具核梭桿菌體外誘導的遷移。

圖2. ICAM1參與了具核梭桿菌誘導的CRC細胞與內皮細胞的粘附和體外遷移。分別用靶向ICAM1的2個siRNA或對照siRNA轉染HCT116細胞的ICAM1的定量RT-PCR（a）和蛋白質印跡分析（b）；（c-d）用特定的siRNA轉染的HCT116細胞的粘附試驗（c）和遷移試驗（d）；在24小時觀察遷移的細胞，比例尺100 μm；（e-f）在HCT116細胞中進行定量RT-PCR（e）和蛋白質印跡分析（f）；用特定的siRNA轉染，然后與具核梭桿菌或PBS共培養；（g-h）用特定的siRNA轉染的HCT116細胞與具核梭桿菌共培養，并進行粘附試驗（g）和遷移試驗（h），在18小時后觀察遷移的細胞，比例尺100 μm；數據顯示為平均值±SD，** P< 0.01, *** P < 0.001, **** P< 0.0001。

3  ICAM1參與具核梭桿菌介導的CRC細胞在體內外滲和轉移

為了進一步評估ICAM1在具核梭桿菌介導的體內跨內皮侵襲和定植中的作用，我們降低了帶GFP標記的HCT116細胞和用具核梭桿菌處理的細胞中的ICAM1表達。癌細胞外滲試驗結果表明，具核梭桿菌顯著促進HCT116細胞外滲，而敲低ICAM1則顯著逆轉HCT116細胞的跨內皮侵襲和定植（圖3a）。此外，我們利用基于慢病毒的shRNA建立了穩定的ICAM1敲低HCT116細胞（圖3b）。與我們之前的研究結果一致，ICAM1的敲低顯著降低了具核梭桿菌誘導的細胞遷移能力（圖3c）。我們用上述細胞靜脈內接種小鼠以測量肺轉移。來自肺部的圖像和H&E染色的結果顯示，具核梭桿菌顯著增加了轉移病灶的數量，而HCT116細胞中ICAM1的敲低顯著減少了具核梭桿菌誘導的肺部病灶轉移（圖3d-e）。總之，這些數據表明具核梭桿菌通過體內ICAM1的上調促進CRC細胞的外滲和轉移。

圖3. ICAM1參與了具核梭桿菌介導的CRC細胞在體內外滲和轉移。（a）用兩種靶向ICAM1的siRNA轉染的帶GFP標記的HCT116癌細胞，與具核梭桿菌或PBS共培養在體內的外滲模型；通過免疫熒光法測定肺組織中定植的HCT116細胞，比例尺100 μm；（b-c）基于慢病毒穩定感染CAM1的shRNA或對照shRNA的HCT116細胞與具核梭桿菌或PBS對照共培養，并進行蛋白質印跡分析（b）和遷移測定（c），在18小時后對遷移的細胞進行定量，比例尺，100 μm；（d-e）將用具核梭桿菌或PBS處理的ICAM1敲低HCT116細胞尾靜脈注射到裸鼠體內以發展肺轉移；具有代表性的肺部切片和H&E染色圖（d），箭頭表示轉移結節；每只小鼠的肺轉移結節數（e）；數據顯示為平均值±SD，** P< 0.01, *** P < 0.001, **** P< 0.0001。

4  具核梭桿菌 通過激活NF - κ B信號通路上調ICAM1的表達

接下來我們試圖探討具核梭桿菌上調ICAM1表達的機制。KEGG通路分析和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）的RNA測序結果表明，具核梭桿菌感染激活了NF-κB信號通路（圖4a-b）。蛋白質印跡分析表明，經具核梭桿菌處理后，HCT116細胞（圖4c）和LoVo細胞（補充圖3a）中NF-κB亞基p65磷酸化水平顯著升高，NF-κ B抑制劑I κ B α磷酸化水平顯著升高，而在大腸桿菌和PBS處理不明顯。免疫熒光試驗也顯示NF-κ B亞基p65在具核梭桿菌處理的細胞中的核定位序列顯著增加（圖4d，補充圖3b）。總的來說，我們的結果表明NF-κ B信號傳導在CRC細胞中被具核梭桿菌處理激活。我們對激活的NF-κB通路是否參與了ICAM的調控產生了疑問。BAY11-7082是一種NF-κ B抑制劑，可用于治療感染具核梭桿菌的CRC 細胞。定量RT-PCR和蛋白質印跡分析均表明，當HCT116細胞（圖4e，f）和LoVo細胞（補充圖3c-d）用NF-κ B處理時，由具核梭桿菌感染誘導的ICAM1上調顯著減弱。此外，p65的敲低還抑制了具核梭桿菌誘導的HCT116細胞（圖 4g-h）和LoVo細胞（補充圖3e-f）中的ICAM1上調。這些結果表明，CRC細胞中ICAM1的上調是由于具核梭桿菌激活了NF-κB信號通路的傳導。正如預期的那樣，HCT116細胞中p65的敲低顯著降低了具核梭桿菌介導的對內皮細胞的粘附以及遷移能力的促進（圖4i-j）。在LoVo細胞中也觀察到類似的結果（補充圖3g）。此外，我們在p65缺失的CRC細胞中重新引入ICAM1水平，發現ICAM1的異位表達可以挽救p65沉默對細胞粘附和遷移的抑制作用（圖 4k-l，補充圖3h-i）。總之，這些結果表明具核梭桿菌處理通過激活NF-κB 信號通路上調ICAM1。

圖4. 具核梭桿菌通過激活NF-κB信號通路上調ICAM1的表達。（a）對503個上調基因的KEGG通路分析，RNA測序存在顯著差異；（b）GSEA顯示在有或沒有具核梭桿菌處理的HCT116細胞中與NF-κB信號通路相關的差異表達基因簇；（c）用具核梭桿菌、大腸桿菌或PBS對照處理的HCT116細胞中磷酸化-I κ Bα、NF-κ B亞基p65和磷酸化-p65的蛋白質印跡分析；（d）免疫熒光檢測NF-κ B p65在HCT116細胞中的分布；細胞用p65特異性抗體（綠色）染色，細胞核用DAPI（藍色）染色，比例尺20 μm；（e-f） HCT116細胞與具核梭桿菌或PBS對照共培養，然后用NF-κ B抑制劑BAY11-7082處理；定量R -PCR（e）和蛋白質印跡分析（f）；（g-h）HCT116細胞轉染靶向p65的兩個siRNA后，與具核梭桿菌或PBS對照組共培養。定量RT-PCR（g）和蛋白質印跡分析（h）；（i-j）標記處理HCT116細胞的黏附實驗（i）和遷移實驗（j），8小時后觀察遷移細胞，比例尺100 μm；（k-l）用指定的質粒轉染的P65敲低的HCT116細胞用于蛋白質印跡分析（k）和粘附試驗（l），比例尺，100 μm；數據顯示為平均值±SD，** P< 0.01, *** P < 0.001, **** P< 0.0001。

5  ALPK1介導對具核梭桿菌感染的NF-κB依賴性反應

接下來我們研究了可以向NF-κB通路傳遞信號并介導具核梭桿菌功能的上游調控因子。有研究表明，Toll樣受體家族參與了腸道菌群-宿主相互作用系統，并且TLR4/MYD88反應在具核梭桿菌干預后被激活。然而，我們在具核梭桿菌處理的HCT116細胞中沉默TLR4或MYD88，發現敲低TLR4或MYD88并不能逆轉具核梭桿菌誘導的黏附能力的提升（補充圖4a）。有趣的是，前人的研究已經證實，具核梭桿菌對經歷非專性細胞內階段的CRC細胞具有獨特的侵襲潛力，并且ALPK1可能作為革蘭氏陰性細菌中存在的ADP-Hep的細胞質中的新模式識別受體。因此，除了TLR4/MYD88在細胞膜上級聯外，具核梭桿菌還可能通過ALPK1激活NF-κ B通路。為了驗證這一假設，我們通過具核梭桿菌、大腸桿菌或PBS對照處理的HCT116細胞，發現具核梭桿菌處理后ALPK1蛋白水平顯著升高（圖5a）。為了進一步明確ALPK1是否參與了具核梭桿菌介導的NF-κB激活的調控，我們在HCT116細胞中利用兩個針對ALPK1不同區域的siRNA敲除ALPK1（圖5b-c）。蛋白質印跡分析表明，沉默ALPK1可阻止NF-κ B通路被具核梭桿菌感染而激活（圖5d），這也通過NF-κ B p65的核定位的免疫熒光測定得到驗證（圖5e）。在LoVo細胞中也觀察到類似的結果（補充圖4b - d）。這些結果表明，具核梭桿菌可以通過上調ALPK1來激活NF-κ B通路。

由于具核梭桿菌能夠激活ALPK1/NF-κ B途徑，我們希望探究該途徑是否可能參與 ICAM1的調節。有趣的是，我們觀察到當ALPK1在HCT116細胞（圖5d）和LoVo細胞（補充圖4c）中沉默時，具核梭桿菌不能上調ICAM1的表達，這表明了ALPK1在具核梭桿菌上調ICAM1依賴性NF-κB途徑中的重要性。隨后，我們試圖探究ALPK1是否介導了具核梭桿菌在CRC發展中的功能。正如預期的那樣，當在具核梭桿菌處理的HCT116細胞中敲除ALPK1時，具核梭桿菌介導的CRC細胞與內皮細胞的粘附減少（圖5f）。同時，沉默ALPK1顯著損壞了具核梭桿菌對細胞遷移的致癌作用（圖5g，補充圖4e）。此外，當我們恢復了ALPK1缺失的CRC 細胞中的ICAM1表達，發現ICAM1的異位表達顯著逆轉了ALPK1沉默對細胞粘附和遷移的抑制作用（圖5h-i，補充圖4f-g）。總之，這些結果表明了具核梭桿菌通過ALPK1/NF-κ B/ICAM1軸促進CRC細胞與內皮細胞粘附以及CRC細胞遷移。為了探索具核梭桿菌對ALPK1/NF-κB/ICAM1軸的特異性，我們進一步探究了用A. muciniphila或B. adolescentis處理的CRC細胞中ALPK1、NF-κ B信號傳導和ICAM1的蛋白水平。蛋白質印跡分析顯示A. muciniphila處理，可以輕微激活ALPK1/NF-κ B途徑（補充圖 4h-i），但B. adolescentis沒有效果。有趣的是，具核梭桿菌處理對ALPK1/NF-κ B信號傳導以及ICAM1表達水平的刺激作用顯著強于A. muciniphila處理（補充圖4h-i）。此外，具核梭桿菌10953 還可以顯著激活HCT116細胞或LoVo細胞中的ALPK1/NF-κB/ICAM1信號傳導，與具核梭桿菌25586相當（補充圖4j-k）。

圖5. ALPK1介導對具核梭桿菌感染的NF-κB依賴性反應。（a）用具核梭桿菌、大腸桿菌或PBS對照處理的HCT116細胞中ALPK1的蛋白質印跡分析；分別轉染靶向ALPK1的siRNA或對照siRNA的HCT116細胞中的ALPK1的定量RT-PCR（b）和蛋白質印跡分析（c）；（d）siRNA轉染的HCT116細胞與具核梭桿菌或PBS對照共培養，進行了ALPK1、p-IκBα、p65、p-p65和ICAM1的蛋白質印跡分析；（e）通過免疫熒光測定法測量細胞中NF-κ B p65的分布，比例尺20 μm；（f-g）siRNA轉染的HCT116細胞與具核梭桿菌或PBS對照共培養，進行粘附試驗（f）和遷移試驗（g）；在18小時后觀察遷移的細胞，比例尺100 μm；（h-i）質粒轉染ALPK1敲除的HCT116細胞用于蛋白質印跡分析（h）和粘附試驗（i），比例尺，100 μm；數據顯示為平均值±SD，** P< 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001。

6  具核梭桿菌豐富度過高與CRC患者ALPK1和ICAM1的高表達相關，表明了不好的臨床結果

最近的研究表明，與正常組織相比，結直腸癌組織中具核梭桿菌的豐富度顯著增加。為了在結腸內建立高豐富度具核梭桿菌環境，我們給預先給藥抗生素3天的C57BL/6小鼠灌胃具核梭桿菌或PBS（圖6a）。處理15天后處死小鼠，取出結腸進行試驗分析。定量RT-PCR分析表明，經具核梭桿菌處理的結腸組織中具核梭桿菌豐富度顯著增加，表明模型構建成功（圖6b）。值得注意的是具核梭桿菌顯著增加了ICAM1的表達（圖6c-d）。此外，我們還建立了一個AOM/DSS誘導的CRC模型，同時進行具核梭桿菌、大腸桿菌或PBS對照處理（補充圖5a-b）。定量RT-PCR分析顯示，與大腸桿菌或PBS對照相比，具核梭桿菌處理的小鼠原位腫瘤組織中ALPK1和ICAM1水平顯著上調（補充圖5c-d）。這些結果證實，小鼠結腸組織中具核梭桿菌的過量導致體內ALPK1和ICAM1的上調。為進一步研究具核梭桿菌/ALPK1/ICAM1的臨床意義，我們采用定量RT-PCR分析98例配對的新鮮CRC組織及癌旁非腫瘤組織（隊列1）中具核梭桿菌豐富度及ALPK1、ICAM1的表達情況。與非腫瘤組織對照相比，CRC組織中具核梭桿菌的相對豐富度更高（補充圖5e）。我們根據CRC組織中具核梭桿菌的水平將這些患者（n = 98）分類，將豐富度前1/2患者定義為高具核梭桿菌組（n = 49），其余的1/2患者定義為低具核梭桿菌組（n = 49）。值得注意的是，我們發現ALPK1和ICAM1的表達在高具核梭桿菌組中顯著升高（圖6e-f）。同樣，CRC腫瘤組織中具核梭桿菌相對豐度與ALPK1水平呈正相關（補充圖5f），與ICAM1水平同樣呈正相關（補充圖5g）。此外，在隊列1和癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫中，ICAM1的mRNA水平與ALPK1表達呈正相關（圖6g，補充圖5h）。更為重要的是，有淋巴結轉移的CRC患者腫瘤組織與無轉移患者相比，ICAM1呈上調趨勢，這表明ICAM1與CRC患者晚期淋巴結轉移呈正相關（圖6h）。

為了進一步探究ALPK1和ICAM1在CRC遠處轉移患者中的臨床意義，我們通過IHC分析（組織陣列隊列2）證實了ALPK1和ICAM1在人CRC組織陣列中的表達。重要的是，ALPK1或ICAM1的高表達與肝轉移陽性顯著相關（圖6i-j），ICAM1的蛋白質水平與ALPK1表達呈正相關（補充圖5i）。此外，我們對隊列2中的患者進行了隨訪，并分析了ALPK1和ICAM1表達情況與患者預后的相關性。Kaplan-Meier分析顯示ALPK1或ICAM1的高表達與CRC患者的較短存活時間顯著相關（圖6k-1）。為了進一步確定具核梭桿菌在CRC轉移中的作用，我們對32例淋巴結轉移陽性（N1 + N2）和40例無淋巴結轉移（N0）的CRC患者糞便樣品中具核梭桿菌的相對豐度進行了定量（隊列3）。正如預期的那樣，在淋巴結轉移陽性的CRC患者中，具核梭桿菌的水平特別高（圖6m）。同時，與正常對照組相比，CRC患者的糞便中富含具核梭桿菌（補充圖5j）。綜上所述，我們的結果表明，在CRC組織中，具核梭桿菌的過量與ALPK1和ICAM1的高表達有關。此外，具有高水平具核梭桿菌、ALPK1或ICAM1的患者出現不良臨床結果的風險更高，這對其臨床管理具有重要意義。

圖6. 具核梭桿菌豐富度過高與CRC患者ALPK1和ICAM1的高表達相關，表明了不好的臨床結果。（a）用抗生素預處理的C57BL/6小鼠每天通過管飼法喂食具核梭桿菌或PBS對照，并在處理15后天處死；（b）定量RT-PCR分析上述處理的小鼠結腸組織中具核梭桿菌的相對豐度（n = 6），數據標準化為Universal Eubacteria 16S；（c）定量RT-PCR分析小鼠（n = 6）結腸組織中ICAM1的mRNA表達情況；（d）小鼠的結腸組織中ICAM1蛋白表達情況的具有代表性IHC圖像；（e-f）定量RT-PCR分析隊列1中由具核梭桿菌豐富度分為兩組的ALPK1（e）和ICAM1（f）表達情況；（g）隊列1中ALPK1和ICAM1相對mRNA水平的相關性；（h）隊列1中不同淋巴結轉移階段CRC患者ICAM1的相對mRNA水平；（i-j）隊列2中有無肝轉移的CRC患者ALPK1（i）和ICAM1（j）的IHC分析，具有代表性圖片見左圖，比例尺50 μm；（k-l）隊列2中CRC患者ALPK1（k）和ICAM1（l）表達情況的Kaplan-Meier生存曲線；（m）隊列3中淋巴結轉移陽性（N1+N2，n = 32）或無轉移（N0，n = 40）的CRC患者糞便中具核梭桿菌的相對豐度；數據顯示為平均值±SD，** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001。

討論

越來越多的研究結果表明，腸道微生物及其代謝產物在結直腸腫瘤發生中發揮了重要作用。在本研究中，我們分析了CRC患者的糞便代謝產物和微生物組，并將其與癌癥前期的CRA患者和健康受試者的糞便代謝產物和微生物組進行了比較分析。我們的結果證明了關鍵的代謝途徑在CRC發病過程中被破壞。綜合代謝組和微生物組分析表明，CRC相關細菌和代謝產物之間的相互作用隨著CRC的發展而改變。重要的是，我們證明了除了細菌外，糞便代謝產物在非侵入性診斷CRC的潛力。

在這項研究中，我們首次揭示了具核梭桿菌可以增強CRC細胞與細胞間粘附能力，促進CRC細胞與內皮細胞的粘附，促進CRC細胞外滲和轉移，為控制CRC細胞轉移提供了一種新的微生物群-宿主相互作用模型（圖7）。從機制上講，核梭桿菌處理通過我們新鑒定的模式識別受體ALPK1激活CRC細胞的NF-κB信號，從而促進ICAM1的表達，對于核梭桿菌誘導的CRC細胞-內皮細胞黏附和轉移至關重要。宏基因組和轉錄組分析表明，腸道微生物群，例如具核梭桿菌、Akkermansia muciniphila和Streptococcus thermophilus參與了CRC的發展。最近的研究中，在轉移性病灶中檢測到具核梭桿菌的存在，表明它可能促進結直腸癌的轉移。有研究表明，具核梭桿菌通過激活KRT7 -AS、上調CARD3激活自噬、誘導具核梭桿菌感染的結直腸癌細胞產生的IL-8和CXCL1或外泌體促進結直腸癌轉移。然而，腫瘤轉移是一個極其復雜的過程，包括癌細胞脫離原發腫瘤，進入血液循環，黏附內皮細胞并外滲，到達遠端形成可見的轉移性病灶。腫瘤細胞與內皮細胞的直接相互作用是跨內皮細胞侵襲和定植的關鍵步驟。調節黏附相關分子的表達可能是改善CRC預后的有效策略。本研究首次發現，具核梭桿菌在體內外均增強了CRC細胞與內皮細胞的黏附，這是具核梭桿菌誘導的CRC細胞與內皮細胞黏附促進CRC轉移的新型串擾。在本研究中，我們分析了具核梭桿菌促進CRC細胞與內皮細胞粘附的機制。在我們的RNA測序結果中鑒定了細胞黏附相關基因與具核梭桿菌上調基因之間的ICAM1重疊，作為具核梭桿菌的直接下游靶點。細胞表面黏附分子ICAM1可促進胰腺導管腺癌、肝細胞癌和結直腸癌的發展。我們發現下調ICAM1在體內外均可降低具核梭桿菌誘導的CRC細胞與內皮細胞黏附和轉移的促進作用。

圖7. 具核梭桿菌誘導的ALPK1/NF-κB/ICAM1軸調控CRC轉移的示意圖。腸道中大量的具核梭桿菌通過新發現的模式識別受體ALPK1激活CRC細胞的NF-κB信號，從而促進ICAM1的表達，這對于具核梭桿菌誘導的CRC細胞內皮細胞黏附、外滲和轉移至關重要。

此外，我們試圖揭示具核梭桿菌調節ICAM1的機制。我們基于RNA測序結果的KEGG分析表明，NF - κ B通路被具核梭桿菌處理激活。同樣，有研究也證實了具核梭桿菌感染細胞后NF - κ B通路的激活。此外，在CRC細胞表面TLR4的識別可能參與了NF - κ B信號通路的持續激活。然而，有研究表明，具核梭桿菌通過FadA、Fap2和FomA等毒力因子黏附和侵襲上皮細胞。此外，最近的研究通過熒光顯微鏡和流式細胞術證實了具核梭桿菌對HCT116細胞的侵襲能力，表明具核梭桿菌可能存在其他途徑激活NF - κ B通路。有趣的是，近期的一項研究發現ALPK1是微生物誘導NF - κ B激活的關鍵中介，是識別α螺旋內磷酸化位點的非典型激酶家族α激酶的成員。一般認為ALPK1接受了革蘭陰性菌中存在的ADP- Hep信號。ALPK1對ADP- Hep的識別代表了先天感知的一種通用形式，介導對多種細菌病原體的免疫應答。在本研究中，我們發現具核梭桿菌能夠誘導ALPK1的表達并持續激活NF - κ B信號通路，沉默ALPK1能夠抑制具核梭桿菌感染引起的NF - κ B活化和ICAM1上調。此外，我們的結果表明，與其他革蘭氏陰性菌相比，具核梭桿菌在ALPK1/NF-κB/ICAM1通路上表現出明顯的激活作用。ALPK1/NF - κ B/ICAM1是具核梭桿菌感染的特異性途徑。然而，我們并沒有對具核梭桿菌激活ALPK1通路的詳細機制進一步研究。有研究報道了類似的方式，幽門螺桿菌通過Ⅳ型分泌系統（T4SS）激活ALPK1 / NF-κB軸。研究具核梭桿菌如何刺激CRC細胞ALPK1的表達，進而影響NF-κB通路，具有重要意義。

此外，我們發現具核梭桿菌和ICAM1/ALPK1在腫瘤轉移的CRC患者中高度富集。此外，具核梭桿菌的相對豐度與CRC組織中ICAM1/ALPK1的水平呈正相關，ICAM1/ALPK1的高表達與CRC患者的存活時間縮短顯著相關。最近的研究報道，具核梭桿菌通過調節Wnt/β-catenin通路、NF-κB通路、自噬、葡萄糖代謝等促進CRC的發生。ALPK1/NF-κB/ICAM1軸至少可以在一定程度上解釋具核梭桿菌處理促進了CRC的轉移。然而，其他機制可能涉及具核梭桿菌誘導的CRC細胞和內皮細胞之間的相互作用，以及隨后的CRC轉移。由于具核梭桿菌的豐富度與CRC轉移的風險相關，因此測量具核梭桿菌豐度可能是預測患者預后的有效方法。我們的研究結果支持這樣的假設：即靶向具核梭桿菌、宿主上皮ICAM1表達和/或ALPK1可能提供阻斷具核梭桿菌誘導的CRC轉移并創造診斷機會的方法。總而言之，我們的研究結果為CRC轉移中具核梭桿菌調節細胞間分子ICAM1的分子機制提供了重要的見解。具核梭桿菌通過ALPK1激活誘導NF-κB 通路，導致ICAM1上調并增強CRC 細胞-內皮細胞粘附和轉移。體外和體內試驗結果表明了具核梭桿菌、ICAM1或ALPK1在CRC患者中具有促轉移作用，因此可以很好地利用針對具核梭桿菌、ICAM1和/或ALPK1的潛在治療策略。