導讀  

       人體微生物組是定植于人體腸道的，在人體免疫系統(tǒng)、食物消化和防止有害細菌方面起著至關重要的作用。據(jù)最近的研究報道人體微生物組會影響結直腸癌（CRC）的治療，但微生物和CRC之間的作用模式仍不清楚。該研究表明，丙酸鹽通過上調HECT結構域E3泛素蛋白連接酶2（HECTD2）從而促進常染色質組蛋白-賴氨酸 N-甲基轉移酶 2（EHMT2）的蛋白酶體降解，進而抑制了CRC的生長。此外，EHMT2下調降低了腫瘤壞死因子α誘導蛋白1（TNFAIP1）啟動子區(qū)域的H3K9me2水平，其中TNFAIP1可以作為EHMT2的新型靶標。隨后，TNFAIP1的上調可以誘導CRC細胞凋亡。研究者使用Bacteroides thetaiotaomicron的培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)HECTD2和TNFAIP1的上調可以降低EHMT2的水平。最后，在3D球體培養(yǎng)模型中研究中觀察到丙酸鹽和EHMT2抑制劑（BIX01294）有協(xié)同抗腫瘤作用。因此，本研究發(fā)現(xiàn)了以下三點：丙酸鹽的抗腫瘤作用，EHMT2可以作為結腸癌治療靶點，并且EHMT2的抑制劑和微生物在CRC中可能有協(xié)調治療作用。

論文ID

原名：Human gut-microbiome-derived propionate coordinates proteasomal degradation via HECTD2 upregulation to target EHMT2 in colorectal cancer

譯名：人體腸道菌群產生的丙酸鹽通過上調HECTD2從而靶向促進結腸癌中EHMT2蛋白酶體的降解

期刊：ISME JOURNAL

IF：10.302

發(fā)表時間：2022.1.1

通訊作者：Doo-Sang Park, Dae-Soo Kim, Mi-Young Son, Hyun-Soo Cho

通訊作者單位：韓國生命工學研究院，韓國科學技術聯(lián)合大學院大學

DOI號：10.1038/s41396-021-01119-1

實驗設計

結果

1 丙酸鹽誘導人結腸癌細胞HCT116和LS174凋亡

       為了檢測丙酸鹽在結腸癌中的抗腫瘤作用，首先發(fā)現(xiàn)了丙酸鈉（SP）在人結腸癌細胞HCT116和LS174T中的IC50分別是2.986mM和11.67mM（附圖S1）。因此選擇了2.5mM和5mM的SP分別給予HCT16和LS174T，研究其在結腸癌細胞中誘導凋亡的作用機制。結晶紫染色（CV）和CCK8實驗表明：相比陰性對照組，SP可以顯著抑制結腸癌細胞生長（圖1A和B）。此外，蛋白質印跡（WB）實驗表明，SP處理的HCT116和LS174T細胞中剪切后的 PARP水平增加（圖1C）。熒光激活細胞分選（FACS）實驗揭示了SP處理后CRC細胞系中半胱天冬酶3/7活性的增加（圖1D）與早期和晚期凋亡的活性一致（圖1E）。SP處理的HCT116細胞進行RNA測序（RNA-seq）分析，發(fā)現(xiàn)了398個上調基因和474個下調基因（超過兩倍）。使用了Cytoscape中的CluGO插件對DEGs進行GO分析（生物過程），發(fā)現(xiàn)SP處理與細胞生長的GO條目“生物過程的負調控”和“細胞死亡的上調”有關（附圖S2）。DAVID分析發(fā)現(xiàn)在“生長的負調控”，“細胞凋亡的正調控”，“細胞黏附”和“炎癥反應”的通路上面有富集（圖1F）。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)SP 處理會影響腫瘤的細胞凋亡，TNF信號通路和轉錄失調（圖1G）。GSEA分析發(fā)現(xiàn)相比對照組SP處理后調控了細胞凋亡（圖1H）。

       為了評估丙酸鹽在正常腸道中的毒性，使用了人多能干細胞（hPSC）衍生的腸道類器官（hIO），并以劑量依賴性的方式給與丙酸鹽（0 mM，1mM，2.5 mM，5 mM）并檢測細胞活力。hPSC衍生的腸道類器官可以很好地模擬人類腸道的環(huán)境和復雜結構，很可能成為藥理和毒理學中疾病模擬和藥物篩選的成功模型。給予不同濃度的SP不影響腸道類器官的活力（圖1I，J和附圖S3）。因此，通過hIO實驗，研究者認為丙酸鹽的起效濃度有效地抑制了結腸癌細胞系的活力，而不影響正常腸道的活力。

圖1 丙酸鹽通過細胞凋亡抑制HCT116和LS174T的細胞生長。A，B 丙酸鈉給予48 h后的細胞生長實驗。HCT116和LS174T細胞在100%甲醇中固定并用結晶紫溶液染色。比例尺是200 μm（A）。細胞在37°C下孵育5 min后加入CCK-8工作液。細胞生長強度用酶標儀在吸光度450nm處檢測。三個獨立實驗的結果取Mean ± SD。p 值是使用學生t檢驗（***p < 0.001）統(tǒng)計的（B）。C 給予丙酸鈉后使用PARP抗體處理的蛋白質印跡分析。ACTB被用作HCT116和LS174T細胞的內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化分析。D 丙酸鈉處理后，使用Muse Caspase 3/7工作溶液進行FACS分析。右上方的表示凋亡細胞和死細胞的比例（左圖）。右邊的柱狀圖展示了半胱天冬酶3/7活性的定量。三個獨立實驗的結果取平均±標準差（Mean ± SD）。 p值是使用學生t檢驗（***p < 0.001，**p < 0.01）統(tǒng)計。E 丙酸鈉處理后對膜聯(lián)蛋白 V 染色進行 FACS 分析。右下和右上象限提示早期和晚期的細胞凋亡（左圖）。右邊的柱狀圖展示了細胞凋亡的定量。三個獨立實驗的結果取Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗（***p < 0.001，**p < 0.01）計算得出的。F DAVID的GO分析了RNA-seq中872個上調或下調基因。G 對872個基因進行DAVID的KEGG通路分析。富集通路如圖所示。H 對872個基因進行GSEA分析。I 不同濃度的丙酸鹽處理后hIO的形態(tài)學的代表性圖像。比例尺是500 μm。J 通過CCK測定不同濃度的丙酸鹽處理后的hIO中的細胞活力。每組 3 個。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值使用學生t檢驗計算（n.s. 表示不顯著）。

2 EHMT2是丙酸鹽誘導的結腸癌細胞凋亡的靶點

       為了驗證SP治療誘導細胞凋亡的影響，研究者研究組蛋白 - 賴氨酸甲基轉移酶（HMT）和去甲基化酶（HDLs），因為已有文獻報道一些HMTs和HDLs在結腸癌中過表達，且敲降HMTs和HDLs可以通過誘導CRC細胞凋亡從而抑制CRC增殖。在計算表觀遺傳學中，從CGA數(shù)據(jù)庫（https://tcga-data.nci.nih.gov/）中選擇了HMTs和HDLs過表達的（1.5倍，結腸癌/正常）521例結腸癌病人和51例正常對照。EHMT2作為SP誘導的CRC細胞凋亡的效應基因（圖2A，附圖S4）。在CRC組織的組織化學分析中，相比正常組織，EHMT2的表達水平在CRC組織中增加（圖2B）。EHMT2是一種參與H3K9二甲基化，在轉錄基因調控中形成異染色質的HMT。此外，文獻已報道在乳腺癌、膀胱癌和肺癌中，EHMT2的敲降參與了細胞凋亡和遷移/侵襲。SP處理CRC細胞系后，在轉錄水平上EHMT2沒有改變；然而，蛋白印記實驗（WB）中，EHMT2的蛋白表達顯著降低（圖2C，D）。SP處理后的免疫細胞化學（ICC）中，與對照細胞相比，SP處理的細胞中EHMT2的強度顯著降低（圖2E）。因此，研究者假設SP可能參與了轉錄修飾和蛋白酶體降解。接下來，為了驗證SP是否誘導EHMT2的蛋白酶體降解，研究者在HCT116和LS174T細胞中用SP和MG132（一種蛋白酶體降解抑制劑）共同處理后進行了WB。共同處理組中，與對照相比SP處理后降低的EHMT2的水平被MG132恢復了，表明SP誘導了EHMT2的蛋白酶體降解（圖2F）。此外，在用CHX，一種蛋白質合成抑制劑處理后，與對照相比，SP誘導的蛋白質降解在CRC細胞系中增加（圖2G）。最后，為了評估SP處理后的EHMT2多泛素化狀態(tài)，研究者用FLAG標記的EHMT2和HA標記的泛素共轉染到用SP和/或MG132處理的HCT116細胞中，并使用抗FLAG抗體進行免疫沉淀實驗。與對照組相比，SP和MG132處理組的EHMT2多泛素化顯著增加（圖2H）。因此，SP通過調節(jié)蛋白酶體降解的翻譯后修飾來影響EHMT2的穩(wěn)定性；進而抑制CRC細胞系的細胞增殖并誘導凋亡。該研究是首次描述丙酸鹽與轉錄后修飾之間關系。

圖2 EHMT2是丙酸鹽誘導的結腸癌細胞凋亡的靶標。A EHMT2在TCGA數(shù)據(jù)庫中正常和CRC樣品中的表達。B EHMT2的免疫組化分析。結腸癌組織微陣列來自BioChain（https://www.biochain.com）。比例尺為200 μm。C RT-PCR分析丙酸鈉處理后的HCT116和LS174T細胞中EHMT2的表達水平。ACTB被用作內參（上部）。下方的柱狀圖是EHMT2表達的qRT-PCR分析。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗（n.s. 表示不顯著）統(tǒng)計的。D 使用抗EHMT2處理給予丙酸鈉后的蛋白質印跡分析。ACTB被用作HCT116和LS174T細胞的內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。E EHMT2的免疫細胞化學分析。給予丙酸鈉后的HCT116細胞用100%甲醇固定，并用抗EHMT2（Alexa Fluor 488，綠色）和DAPI（藍色）進行染色。比例尺為50 μm。F 使用抗EHMT2對SP處理24h和MG132處理6h后的蛋白質印跡分析。ACTB被用作HCT116和LS174T細胞的內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。G SP處理24 h后EHMT2和環(huán)己酰亞胺（CHX）12和24 h的G蛋白質印跡分析，以ACTB為內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。H SP誘導 EHMT2 的泛素化。用FLAG標記的EHMT2和HA標記的泛素表達載體共轉染后， SP處理24h和MG132處理6 h，使用HA和FLAG抗體進行蛋白質印跡分析。 

3 SP 誘導 HECTD2 的表達從而降解 EHMT2

       為了研究SP處理后EHMT2的降解機制，研究者重新分析了RNA測序數(shù)據(jù)（選擇49個E3泛素連接酶），發(fā)現(xiàn)了與對照處理相比，7個E3連接酶（HECTD2，HECTD3，HERC1，HERC6，NEURL1B和RNF128）上調（圖3A）。為了驗證蛋白酶體降解與E3連接酶的關系，研究者使用siRNA和SP處理后，觀察到敲降HECTD2有助于恢復SP處理誘導的EHMT2降解（附圖S5）。qRT-PCR和WB再次確認了SP處理可以上調HECTD2的表達（圖3B）。已有報道：短鏈脂肪酸，例如丁酸和丙酸，可以抑制腫瘤細胞的HDAC活性。因此，在HCT116細胞中用SP處理后進行了WB。與對照組相比，SP處理提高了H3K27的乙酰化狀態(tài)；而H3K9的乙酰化狀態(tài)沒有顯著改變（圖3C）。因此選擇H3K27乙酰化來評估SP處理后HECTD2的表達。接下來，在SP處理后的HCT116細胞中使用組蛋白H3K27乙酰化抗體進行ChIP實驗，發(fā)現(xiàn)了HECTD2啟動子區(qū)域H3K27乙酰化狀態(tài)的增加（圖3D）。研究結果表明，微生物組產生的丙酸鹽抑制HDAC的活性，從而上調了結腸癌中HECTD2的表達。

       HECTD2是一種E3連接酶，是從E2泛素偶聯(lián)酶轉移泛素的底物。在HECTD2的siRNA實驗中，敲降HECTD2可以抑制SP對EHMT2的降解（圖3E）。CHX處理后，相比對照siRNA，siHECTD2處理降低了SP處理后EHMT2的降解速率（圖3F）。此外，研究者還檢測到siHECTD2和SP處理組中多泛素化狀態(tài)的降低（圖3G）。半胱天冬酶3/7的FACS實驗發(fā)現(xiàn)，與單獨SP處理組相比，siHECTD2和SP共處理降低了半胱天冬酶3/7活性（圖3H）。因此，SP可能誘導HECTD2的表達促進了EHMT2的蛋白酶體降解；同時EHMT2的降低誘導了細胞凋亡從而抑制了結腸癌的生長。

 圖3 SP處理誘導HECTD2表達從而降解EHMT2。A 對照和SP處理后RNA-seq數(shù)據(jù)（E3泛素連接酶）的熱圖。B SP處理后HECTD2的qRT-PCR分析。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗（**p < 0.01，***p < 0.001）統(tǒng)計（上方的柱狀圖）。使用抗HECTD2處理給予丙酸鈉后的蛋白質印跡分析。ACTB被用作HCT116細胞的內參（下方）。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。C 在HCT116細胞中用SP處理24h后組蛋白H3K27乙酰化（左）和H3K9乙酰化（右）的蛋白質印跡分析。組蛋白H3用作內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。D 使用抗H3K27ac抗體進行ChIP測定。SP處理后的HCT116細胞作為對照，結果顯示為輸入染色質的富集倍數(shù)。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗 （***p < 0.001）統(tǒng)計。E 在HCT116細胞中用siHECTD2和SP處理24 h后EHMT2的WB分析。ACTB被用作內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。F 在HCT116細胞中用siHECTD2和SP處理24h或CHX處理12h后EHMT2的WB分析。ACTB被用作內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。G HCT116細胞中用FLAG標記的EHMT2和HA標記的泛素表達載體轉染后，再用siHECTD2和SP處理24h或MG132處理6h，HA和FALG抗體的蛋白印記分析。H 在HECTD2敲降和SP共處理的HCT116細胞中使用Muse Caspase 3/7工作溶液進行FACS分析。右上方面板表示凋亡和死細胞的比例（上）。下面的柱狀圖表示半胱天冬酶3/7活性的定量結果。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗 （***p < 0.001） 計算的。

4 EHMT2的敲降參與了CRC細胞的凋亡

       EHMT2敲降后的RNA測序結果表明，與siCont對照組相比，GO分析中富集的通路有“凋亡過程”、“細胞周期”和“有絲分裂細胞周期的調節(jié)”（圖4A）。為了驗證SP處理的EHMT2下調是否誘導細胞凋亡，研究者設計了EHMT2的特異性siRNA，并用EHMT2 siRNA處理后進行了細胞生長測定。與siCont對照組相比，通過CV染色和CCK-8測定發(fā)現(xiàn)SP處理后EHMT2的敲降抑制了CRC細胞系中的細胞生長（圖4B，C）。WB表明EHMT2敲降增加了剪切后的PARP（圖4D）。FACS發(fā)現(xiàn)敲降EHMT2上調了CRC細胞系中半胱天冬酶3/7的活性（圖4E）。與siCont對照組相比，敲降EHMT2增加了早期和晚期凋亡細胞的數(shù)量（圖4F）。因此，研究者認為SP處理后EHMT2的下調誘導了CRC細胞系中細胞凋亡從而抑制細胞增殖，表明EHMT2是SP誘導細胞凋亡的關鍵蛋白。

  5 在誘導CRC細胞凋亡的過程中TNFAIP1是EHMT2的直接靶標

       為了驗證EHMT2是直接靶點，siEHMT2處理后進行了ChIP-seq分析，研究SP誘導細胞凋亡后的TNFAIP1基因的表達，因為與siCont組相比，siEHMT2組的TNFAIP1啟動子區(qū)域的H3K9二甲基化狀態(tài)降低（圖4G）。為了證實這一結果，使用EHMT2 siRNA處理后進行了另一次ChIP測定。研究者設計了兩種針對TNFAIP1啟動子區(qū)域的ChIP引物（P1和P2），并使用抗H3K9me2和抗H3K9ac抗體進行ChIP測定（圖4H）。與siCont組相比，敲降EHMT2后TNFAIP1基因啟動子區(qū)的H3K9二甲基化狀態(tài)顯著降低。此外，TNFAIP1基因啟動子區(qū)域的H3K9乙酰化增加，表明EHMT2通過改變染色質結構直接調節(jié)TNFAIP1的表達（圖4I，J）。

圖4 EHMT2的敲降參與CRC細胞凋亡。A GO富集通路網(wǎng)絡。ClueGO分析EHMT2敲降組和對照組中的GO通路富集網(wǎng)絡。功能網(wǎng)絡組中的p值在> 0.05處截斷 。B 用EHMT2 siRNA和siCont（陰性對照）處理后的EHMT2的qRT-PCR分析。p值是使用學生t檢驗（**p < 0.01）統(tǒng)計（左）。用siEHMT2和siCont處理48h后進行細胞生長測定，將HCT116和LS174T細胞固定在100%甲醇中并用結晶紫溶液染色。比例尺是200 μm（右）。C CCK-8 測定。用siEHMT2和siCont處理后在培養(yǎng)基中加入CCK-8工作溶液，37°C孵育5分鐘。使用酶標儀（450nm）測量細胞生長的強度。p值是使用學生t檢驗 （***p < 0.001） 統(tǒng)計。D 使用抗EHMT2和抗PARP抗體進行EHMT2敲降后的WB。ACTB被用作HCT116和LS174T細胞的內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。E 在EHMT2敲降后使用Muse Caspase 3/7工作溶液進行FACS。右上方表示凋亡和死細胞的比例（左圖）。半胱天冬酶3/7活性的定量。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗（***p < 0.001，**p < 0.01）統(tǒng)計（右圖）。F 在EHMT2敲降后對膜聯(lián)蛋白V染色進行FACS。右下和右上象限分別表示早期和晚期凋亡（左）。細胞凋亡的定量。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗（**p < 0.01）（右）統(tǒng)計。G ChIP-seq 分析。TNFAIP1 基因啟動子區(qū)中 H3K9me2 （siCont） 和 H3K9me2 （siEHMT2） ChIP 信號的代表性 IGV 視圖。啟動子區(qū)域被定義為從轉錄起始位點（TSS）到TSS上游1 kb的區(qū)域。Y 軸刻度反映了使用 deepTools（v3.3.0）的 RPGC（每 10 bp/比例因子的讀取次數(shù)，平均覆蓋率為 1×）的標準化讀取次數(shù)。H3K9me2 （siCont） 的歸一化后為 0–8.67，H3K9me2 （siEHMT2） 的歸一化后為 0–7.93。H TNFAIP1啟動子區(qū)域ChIP引物設計圖形摘要。I，J使用抗H3K9me2（I）和抗H3K9ac（J）抗體進行ChIP測定。結果以siEHMT2處理后的HCT116細胞中輸入染色質與對照組相比的百分比進行比較表示。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗統(tǒng)計（***p < 0.001）。

  6 EHMT2對TNFAIP1的表觀遺傳調控誘導結直腸癌細胞凋亡

       EHMT2通過H3K9二甲基化形成異染色質結構從而參與基因表達的負調控。因此，敲降EHMT2后由EHMT2直接調節(jié)的候選基因是需要上調的關鍵基因。TNFAIP1是由IL-6和TNFα誘導的上游反應基因，參與細胞凋亡，DNA修復和DNA合成。在胃癌中，敲降miR-372誘導的TNFAIP1過表達可以調節(jié)NF-κB信號通路促進細胞凋亡。在HeLa細胞系中，過表達TNFAIP1可以下調NF-κB信號通路來增加細胞凋亡。因此，研究者選擇TNFAIP1作為EHMT2誘導細胞凋亡的靶標。RNA-seq發(fā)現(xiàn)在CRC細胞系中，SP處理后和EHMT2敲低后TNFAIP1表達上調， qRT-PCR也證實了這一結果，預示SP下調EHMT2的表達誘導TNFAIP1（圖5A）。ICC結果顯示相比對照細胞，SP或siEHMT2處理后TNFAIP1的強度增加（圖5B）。因此，研究者猜測EHMT2的下調在轉錄水平上誘導TNFAIP1表達。接下來，為了驗證TNFAIP1和敲降EHMT2之間的關系，研究者在表型水平上進行了CV染色和CCK-8的細胞生長實驗。與單獨siEHMT2處理組相比，EHMT2和TNFAIP1 siRNA共處理的細胞生長恢復（圖5C，D）。WB結果顯示EHMT2敲降引起的PARP增加可以被siEHMT2和siTNFAIP1共處理減少（圖5E）。此外，F(xiàn)ACS表明，EHMT2和TNFAIP1 siRNA共處理會降低半胱天冬酶3/7活性（圖5F）。因此，TNFAIP1是CRC細胞系中SP處理后EHMT2降解的效應基因。

接下來，為了確認EHMT2和TNFAIP1之間的相互作用，研究者對TCGA數(shù)據(jù)庫的公共CRC RNA-seq數(shù)據(jù)進行了相關性分析。EHMT2和TNFAIP1呈負相關（圖5G；R2 = –0.2；p = 0.04）。因此，研究者認為SP誘導的EHMT2蛋白酶體降解減少了TNFAIP1啟動子區(qū)域中的H3K9二甲基化；從而上調TNFAIP1增加了CRC細胞的凋亡。

圖5 EHMT2對TNFAIP1的負調節(jié)誘導CRC細胞凋亡。A SP或siEHMT2處理后的RNA-seq中TNFAIP1的表達水平（上部）。SP或siEHMT2處理后TNFAIP1的qRT-PCR。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗 （***p < 0.001） 統(tǒng)計。B TNFAIP1的免疫細胞化學分析。SP或siEHMT2處理的HCT116細胞用100%甲醇固定，并用抗TNFAIP1（Alexa Fluor 488，綠色）和DAPI（藍色）染色。比例尺是50 μm。C，D siTNFAIP1和siEHMT2共轉染48h后細胞生長測定。將HCT116細胞固定在100%甲醇中并用結晶紫溶液染色。比例尺為200 μm （C）。將CCK-8溶液加入培養(yǎng)基中，37°C孵育5分鐘。使用酶標儀（450nm）測量細胞生長的強度。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗 （***p < 0.001）統(tǒng)計（D）。E 使用抗 PARP、抗 EHMT2 和抗 TNFAIP1 抗體對 siEHMT2 和 siTNFAIP1 共轉染后的WB。ACTB被用作HCT116細胞的內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。F siEHMT2和siTNFAIP1共轉染后，使用Muse Caspase 3/7工作溶液進行FACS分析。右上方面板表示凋亡細胞和死細胞比例（上圖）。下圖是半胱天冬酶3/7活性的定量。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗 （***p< 0.001） 計算的。G GTEx 中 EHMT2 和 TNFAIP1 的散點圖。虛線表示 EHMT2 和 TNFAIP1 線性回歸線。采用Person相關法計算兩個基因之間的p值和相關系數(shù)（r）。   

7 人類腸道微生物中細菌的培養(yǎng)基通過上調TNFAIP1來抑制HCT116細胞的生長

       為了驗證人類微生物衍生的丙酸鹽是否通過下調EHMT2來抑制CRC生長，研究者使用人類腸道微生物BT設計了另一個實驗。結腸中，擬桿菌屬是人類微生物的主要群體，BT是僅次于脆弱擬桿菌的第二大可以分離的細菌。BT 是一種革蘭氏陰性嚴格厭氧菌。這種細菌參與多糖代謝，例如膳食碳水化合物中糖苷鍵的水解。首先，通過HPLC分析來分析BT培養(yǎng)上清液（Sup）中丙酸鹽的產生。HPLC結果顯示BT Sup中丙酸鹽（2.172 g / l）的產生（圖6A）。為了驗證BT在結腸癌中的抗腫瘤作用，將BT Sup添加到CRC細胞系的培養(yǎng)基中。與對照組（僅培養(yǎng)基）相比，CV染色和CCK實驗發(fā)現(xiàn)BT Sup處理組的細胞生長受到顯著抑制（圖6B，C）。WB實驗表明BT Sup處理增加了剪切后的PARP，這意味著BT的丙酸鹽可能通過誘導細胞凋亡來抑制CRC細胞系生長（圖6D）。接下來，研究者用BT Sup處理HCT116細胞后的做了WB和qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)BT Sup處理降低了EHMT2的蛋白質水平的表達，但沒有降低轉錄水平（圖6E，F(xiàn)）。此外，與對照細胞相比，ICC顯示BT處理后細胞中EHMT2的強度顯著降低（圖6G）。qRT-PCR結果顯示BT Sup處理組上調了HECTD2和TNFAIP1表達（圖6H）。最后，ICC分析顯示BT Sup處理顯著增加了TNFAIP1的表達（圖6G）。

       已有報道發(fā)現(xiàn)SCFAs（丙酸鹽，丁酸鹽）通過抑制HDAC活性誘導組蛋白H4高乙酰化。由于丁酸鹽也有與丙酸鹽相似的HDAC抑制活性，研究者假設BT Sup中的丁酸鹽也可能和SP一樣通過HECTD2-EHMT2-TNFAIP1軸，誘導H3K27乙酰化來降低HECTD2，從而抑制結腸癌細胞系的生長。為了驗證這一假設，研究者在HCT116細胞中用丁酸鈉（SB）處理后進行了細胞生長測定，并在CCK實驗中發(fā)現(xiàn)了SB處理后細胞生長被抑制（附圖S6A）。WB和FACS中觀察到剪切后的PARP和半胱天冬酶3/7活性的增加，表明SB處理也誘導細胞凋亡（附圖S6B，C）。為了驗證SB處理后HECTD2-EHMT2-TNFAIP1軸的作用，qRT-PCR和ICC實驗證明SB處理后誘導了HECTD2和TNFAIP1表達（附圖S6D，E）。WB和ICC結果顯示SB處理后EHMT2表達顯著降低。接下來，為了檢測SB是否影響H3K27乙酰化，用SB處理HCT116細胞后對H3K27的乙酰化做了WB，與對照組相比，H3K27乙酰化的增加（附圖S6F）。此外，在用H3K27乙酰化抗體進行ChIP分析中，研究者清楚地發(fā)現(xiàn)H3K27乙酰化狀態(tài)在HECTD2啟動子區(qū)域富（附圖S6G）。最后在HCT116細胞系中用SB和siHECTD2共處理，SB處理誘導的半胱天冬酶3/7活性因siHECTD2而降低（附圖S6H）。因此，研究者認為微生物產生的丁酸鹽和SP類似，通過調控HECTD2-EHMT2-TNFAIP1軸和HDAC活性來抑制結腸癌的生長。

       研究者還選擇了Collinesella aerofaciens（CA）作為陰性對照，一種人腸道中的革蘭氏陽性細菌。HPLC分析沒有在CA上清液中檢測到丙酸鹽和丁酸鹽（圖6I）。使用CA Sup研究HCT116細胞系中的HECTD2-EHMT2-TNFAIP1軸作用。CV染色實驗未發(fā)現(xiàn)生長抑制（圖6J）。qRT-PCR中CA sup略微增加了TNFAIP1的表達，但不影響HECTD2表達（圖6K）。此外，WB和ICC未檢測到EHMT2和TNFAIP1表達的變化（圖6L，M）。綜上所述，研究者認為人體微生物產生SCFA（包括BT）在預防結腸癌方面起著重要作用。

 圖6 BT培養(yǎng)的上清液通過丙酸鹽誘導細胞凋亡抑制HCT116和LS174T細胞的生長。A 使用高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)（1200系列，美國安捷倫）測定代謝物的濃度，該系統(tǒng)具有折射率檢測器（RID）和離子交換柱（300×78 mm；Aminex HPX-87H；Bio-Rad，美國）。流動相為2.5 mM H2SO4，流速為0.6 ml/min，柱溫為65 °C，RID保持在45 °C。B，C BT Sup處理48h后細胞生長測定（結晶紫染色和CCK-8測定）。將HCT116細胞固定在100%甲醇中并用結晶紫溶液染色。比例尺為200 μm。（B）將CCK-8溶液加入細胞培養(yǎng)基中，37°C孵育5 min。使用酶標儀（450nm）測量細胞生長的強度（C）。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗 （***p < 0.001）統(tǒng)計的。D 使用抗PARP進行BT Sup處理后的WB。ACTB被用作HCT116細胞的內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。E BT Sup處理后EHMT2表達的qRT-PCR。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗 （**p < 0.01） 統(tǒng)計的。F 使用抗EHMT2進行BT sup處理后的WB。ACTB是內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。G EHMT2和TNFAIP1的免疫細胞化學分析。BT Sup處理的HCT116細胞用100%甲醇固定，并用抗EHMT2和抗TNFAIP1（Alexa Fluor 488，綠色）和DAPI（藍色）染色。比例尺為50 μm。H BT Sup處理后HECTD2和TNFAIP1的qRT-PCR。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗統(tǒng)計的（***p < 0.001，**p < 0.01）。I 使用高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)測定代謝物的濃度。J CA Sup處理48h后進行細胞生長測定（結晶紫染色），將HCT116細胞固定在100%甲醇中并用結晶紫溶液染色。比例尺是200 μm。K CA Sup處理后 EHMT2、HECTD2 和 TNFAIP1 的mRNA表達的qRT-PCR 。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗統(tǒng)計的（*p < 0.05，n.s. 不顯著）。L 使用抗 EHMT2 和抗 PARP 抗體進行 CA Sup處理后的WB。ACTB被用作內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。M EHMT2和TNFAIP1的免疫細胞化學分析。CA Sup處理的HCT116細胞用100%甲醇固定，并用抗EHMT2，抗TNFAIP1（Alexa Fluor 488，綠色）和DAPI（藍色）染色。比例尺為50 μm。   

8 EHMT2是CRC的治療靶點

       通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫結腸癌和正常組織的RNA-seq結果，研究者確定了EHMT2在CRC中的預后值。與低表達的EHMT2組相比，高表達的EHMT2組預后較差（p = 0.043；圖7A），表明EHMT2是CRC治療的潛在靶點。使用了BIX01294抑制劑（EHMT2活性的特異性抑制劑）研究EHMT2作為CRC的治療靶點。BIX01294處理后，RT-PCR和ICC發(fā)現(xiàn)EHMT2活性的降低顯著增加了TNFAIP1的表達（圖7B，C），CV染色顯示細胞生長下降（圖7D）。BIX01294處理后的ChIP測定中發(fā)現(xiàn)H3K9me2降低，TNFAIP1啟動子區(qū)域的H3K9ac增加（圖7E）。此外，BIX01294處理增加了的剪切后的PARP（WB）和半胱天冬酶3/7活性（FACS）（圖7F，G）。BIX01294處理后的CRC細胞系中，早期和晚期凋亡細胞增加（圖7H）。為了驗證EHMT2失活在體內的CRC生長抑制作用，我們用BIX01294進行了移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)BIX01294治療組的腫瘤大小與對照組相比減小（圖7I-K）。

圖7 EHMT2是CRC的治療靶點。A GTEx 數(shù)據(jù)庫的CRC樣本中總生存率的 Kaplan-Meier 圖。與高EHMT2組相比，低EHMT2組的生存率顯著提高（p = 0.043）。B BX01294處理后TNFAIP1的qRT-PCR分析。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗 （***p < 0.001） 統(tǒng)計的。C TNFAIP1的免疫細胞化學分析。BIX01294處理的HCT116細胞用100%甲醇固定，并用抗TNFAIP1（Alexa Fluor 488，綠色）和DAPI（藍色）染色。比例尺為50 μm。D BIX01294處理后的細胞生長實驗。將HCT116和LS174T細胞固定在100%甲醇中并用結晶紫溶液染色后進行。比例尺為200 μm。E 使用抗H3K9me2（左）和抗H3K9ac（右）抗體進行ChIP測定。結果表示為BIX01294處理后HCT116細胞中染色質與對照組的百分比。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗計算的（***p < 0.001）。F 使用抗PARP和抗EHMT2抗體進行BIX01294處理后的WB。ACTB被用作HCT116和LS174T細胞的內參。使用ImageJ軟件對信號強度進行量化。G BIX01294處理后，使用Muse Caspase 3/7工作溶液進行FACS分析。右上方表示凋亡細胞和死細胞的比例（左圖）。右圖表示半胱天冬酶3/7活性的定量。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗（***p < 0.001，**p < 0.01）計算得出的。H 在BIX01294處理后對膜聯(lián)蛋白V染色進行FACS分析。右下和右上象限分別提示早期凋亡和晚期凋亡。右圖是細胞凋亡的定量。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗（***p < 0.001）計算得出的。I–K BIX01294處理抑制裸鼠移植瘤的腫瘤。在HCT116細胞植入后，對照組或BIX01294每周腹腔注射三次。I 第23天腫瘤的宏觀圖像，J腫瘤體積[使用雙端方差分析計算p值（***p < 0.001）]和K腫瘤重量[使用學生t檢驗計算p值（*p < 0.01）]。   

9 丙酸鹽和BIX01294在HCT116細胞系3D球體模型中的協(xié)同效應

       為了驗證在結腸癌中，丙酸鹽作用和SP和EHMT2抑制劑（BIX01294）共處理協(xié)同作用，研究者使用ULA板的3D球體模型系統(tǒng)。3D球體模型系統(tǒng)可以反映腫瘤生理條件和復雜結構，是用于癌癥治療的靶點研究和抗癌藥物開發(fā)的有效模型。首先，在ULA板中培養(yǎng)HCT116細胞，在第4天檢測到HCT116細胞的球狀體。與陰性對照（僅PBS）相比，SP處理使球體的聚集松動（圖 8A）。為了檢測球體的解離，使用E-鈣粘蛋白（CDH1）——一種細胞聚集的標志物，E-鈣粘蛋白的表達會因球體解離而降低。與對照組相比，qRT-PCR顯示SP處理組的E-鈣粘蛋白的表達降低。此外，SP處理后觀察到與前面細胞實驗一致的結果：HECTD2和TNFAIP1上調（圖8B）；WB發(fā)現(xiàn)SP處理后EHMT2表達降低；與PBS相比，SP處理增加了剪切后的PARP（圖8C）。因此，研究者證實了SP在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中的抗腫瘤作用，表明產生SP的微生物可以預防結腸癌的發(fā)展。

       接下來，為了驗證SP和EHMT2抑制劑共處理的協(xié)同作用，使用HCT116細胞系的3D培養(yǎng)系統(tǒng)。在明場圖像中，和對照組和單處理組（SP或BIX01294）相比，第2天SP / BIX01294共處理組中的共培養(yǎng)球體解離最強，這表明第4天（僅SP）和第2天（SP和BIX01294）之間存在協(xié)同效應（圖8D）。qRT-PCR顯示共處理組的HECTD2和TNFAIP1的表達顯著增加（圖8E）。此外，與其他組相比，共處理組的剪切后的PARP增加（圖8F）。綜上所述，對于結腸癌治療，如果患者在攝入產生丙酸鹽的微生物時使用EHMT2抑制劑，預計會有更好的抗腫瘤作用。

 圖8 SP和BIX01294在3D球體模型中的協(xié)同效應。A 使用HCT116細胞系進行3D球體模型培養(yǎng)。用SP（0和10mM）處理的細胞接種到ULA板上并孵育4天。每天在顯微鏡下拍攝細胞。比例尺是500 μm（左）。4天時球體增大（右）。紅線：解離的細胞。白線：聚合單元格。B 4天后對 HECTD2、TNFAIP1 和 CDH1 進行qRT-PCR。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗統(tǒng)計的（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。C 使用抗EHMT2和抗PARP抗體進行SP處理后的WB。ACTB被用作內參。D 用HCT116細胞系進行3D球體模型培養(yǎng)。將SP和BIX01294共處理的細胞接種到ULA板上并孵育2天。每天在顯微鏡下拍攝細胞。比例尺為500 μm。2天內球體擴大。紅線：解離的細胞。白線：聚合單元格（左）。使用ImageJ軟件測量球體的大小（右）。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗（***p < 0.001）統(tǒng)計的。E 2天后對HECTD2、TNFAIP1和CDH1進行qRT-PCR。三個獨立實驗的Mean ± SD。p值是使用學生t檢驗統(tǒng)計的（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。F 使用抗EHMT2和抗PARP抗體進行SP處理后的WB。ACTB被用作內參。

討論

       SCFAs如丁酸鹽（SB）和丙酸鹽（SP）可作為HDAC抑制劑，影響基因的轉錄調控。在CRC中用SCFAs治療后，觀察到啟動子區(qū)域的組蛋白乙酰化可以上調細胞凋亡相關基因，這意味著SCFAs是有用的抗腫瘤的抑制劑。此外，產生SCFAs的微生物也被發(fā)現(xiàn)對健康有益。迄今為止，SCFAs的基因調控主要發(fā)生在轉錄水平上，

       目前還沒有研究表明結腸癌中翻譯后修飾與SCFA治療之間的關系。因此，本研究發(fā)現(xiàn)SP增加CRC細胞中EHMT2蛋白酶體降解，提出了SP在CRC細胞系中的新功能。

       為了快速消除細胞中的蛋白質，泛素-蛋白酶體途徑是新蛋白質合成過程中小肽循環(huán)利用的有效途徑。在蛋白酶體降解途徑中，由E3復合蛋白與蛋白酶體結合的多泛素化蛋白被展開并降解。最近文獻報道蛋白酶體本身是癌癥治療的潛在靶點。在CRC細胞系中，相比單獨SP處理組，SP和MG132共處理后挽救了EHMT2的表達。此外， CHX和SP共處理組中EHMT2的降解速度更快，表明SP可以誘導EHMT2蛋白酶體降解（圖2F，G）。RNA-seq和qRT-PCR結果顯示SP和BT Sup處理組中的HECTD2上調從而促進EHMT2降解。GENT分析（http://gent2.appex.kr/gent2/）發(fā)現(xiàn)對照組和CRC樣品之間HECTD2的表達水平?jīng)]有差異（附圖S7），暗示SP在CRC中引發(fā)的HECTD2上調是通過誘導多泛素化促進EHMT2蛋白酶體降解。

1 腸道微生物產生的丙酸鹽可以誘導結腸癌的細胞凋亡

       為了研究SP在CRC細胞系中的抗腫瘤活性，研究者選擇適當?shù)腟P濃度（2.5~5mM）進行實驗，發(fā)現(xiàn)在HCT116和LS174T細胞系中SP可以誘導細胞凋亡。SCFAs，如丙酸鹽，丁酸鹽和乙酸鹽是人體結腸中的微生物利用膳食纖維發(fā)生的發(fā)酵產物。在人結腸腔中，丙酸鹽和乙酸鹽的濃度為10~100mM；因此，研究者認為本研究中使用的丙酸鹽濃度是適合測試該分子的抗腫瘤的作用濃度。此外，使用hPSC衍生的腸道類器官進行了細胞生長測定。在圖1I和J中2.5和5mM SP不影響hIO細胞的活力，HCT116細胞在丙酸鹽組中受到顯著抑制。

       本研究使用了BT Sup來研究CRC細胞系中的SP效應。BT Sup的HPLC結果揭示了各種代謝物。其中HCT116細胞系中乳酸，乙酸鹽和丁酸鹽的IC50值分別為29.21，27.51和1.38 mM。WB中只有丁酸鹽處理誘導了HCT116細胞系中剪切PARP的增加（附圖S8）。因此，研究者認為BT Sup的丙酸鹽和丁酸鹽通過調節(jié)HECTD2-EHMT2-TNFAIP1軸抑制了HCT116細胞系的增殖。單獨BT并不能代表腸道微生物群。然而，由于SCFAs在結腸癌中的作用機制尚不清楚，因此在這項研究中，研究者專注于SP誘導的結腸癌細胞凋亡的分子機制。最后，研究者確定了SP誘導的結腸癌細胞凋亡的表觀遺傳調控和分子靶標。由于需要使用SP產生菌進一步評估這個分子機制，研究者們選擇了BT上清液并通過BT sup處理確認了HECTD2-EHMT2-TNFAIP1軸的作用，這意味著腸道中產生SP的細菌（包括BT）可以抑制結腸癌的增殖并誘導細胞凋亡。

2 SP和BIX01294可以協(xié)同抑制CRC

       為了驗證SP和BIX01294的協(xié)同作用，研究者采用三維（3D）球體模型系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)SP處理通過HECTD2-EHMT2-TNFAIP1軸增加了CRC的細胞凋亡。在單獨SP處理組中，培養(yǎng)4天觀察到細胞凋亡。然而，在SP和BIX01294共處理時，剪切后的PARP在2天時增加。因此，研究者認為SP下調EHMT2和BIX01294抑制EHMT2活性可能對CRC 3D球體模型的抑制具有協(xié)同效應。然而，盡管3D模型可以模擬腫瘤生理條件和結構復雜性，但3D球體模型系統(tǒng)在確認體外結果方面仍然存在局限性。因此，為了克服體外試驗的局限性，需要進一步的體內研究來驗證腸道微生物合成的SP與腸道CRC之間的直接聯(lián)系。

       迄今為止，SP在癌癥中的臨床應用尚未進行，盡管SP在幾種類型的腫瘤中顯示出抗腫瘤作用，SCFAs在維持上皮細胞促進結腸健康方面起著關鍵作用。因此，盡管尚未進行SP的臨床研究，但根據(jù)體外結果，研究者建議：（1）攝入有益的可以產生SP的微生物以抑制CRC生長;（2）利用膳食纖維增加丙SP的生產;（3）篩選SP高產量的新型微生物。

結論

       丙酸鹽在結腸癌中通過促進蛋白酶體降解降低了EHMT2的蛋白質穩(wěn)定性。EHMT2表達的降低也降低了TNFAIP1啟動子區(qū)域中組蛋白H3K9二甲基化的水平。最后，通過表觀遺傳調控的TNFAIP1上調抑制了CRC增殖（圖9）。因此，本研究的結果表明，結腸中微生物對預防結腸癌的重要性，并且SCFAs（例如丙酸鹽）和HMT特異性抑制劑可能對結腸癌治療顯示出協(xié)同作用。此外，強調CRC患者的飲食治療可以幫助治愈CRC。

圖9 SP誘導的CRC細胞凋亡的示意圖。人類腸道微生物組衍生的丙酸鹽通過上調HECTD2降低了EHMT2的蛋白質穩(wěn)定性。隨后，TNFAIP1作為EHMT2的新型直接靶點可以誘導了結腸癌的凋亡。