本期《學(xué)術(shù)先聲》欄目分享空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院盧瑗瑗教授、趙曉迪教授和樊代明院士研究團(tuán)隊(duì)與先聲診斷科研團(tuán)隊(duì)近期合作發(fā)表在Molecular Cancer（IF=27.401）上的一篇研究[1]。研究團(tuán)隊(duì)前期研究（Nature Medicine, 2017）發(fā)現(xiàn)一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）——MIR100HG，其內(nèi)嵌基因miR-100和miR-125b是結(jié)直腸癌西妥昔單抗耐藥潛在標(biāo)志物。在本研究中，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn) MIR100HG可以不依賴microRNA，而是通過與m6A識(shí)別蛋白（reader）hnRNPA2B1相互作用的形式來調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的西妥昔單抗耐藥抵抗和腫瘤轉(zhuǎn)移能力。這種相互作用，可以通過調(diào)控m6A修飾，增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路下游效應(yīng)分子TCF7L2的mRNA穩(wěn)定性，從而上調(diào)Wnt通路的轉(zhuǎn)錄活性；并且TCF7L2反過來也可以激活MIR100HG轉(zhuǎn)錄，從而形成MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2的正反饋調(diào)控回路。本研究揭示了結(jié)直腸癌西妥昔單抗治療耐藥、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）、腫瘤轉(zhuǎn)移的表觀遺傳學(xué)原因，并為之提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

研究背景

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是全球第三大新發(fā)癌種，也是腫瘤相關(guān)死亡的第二大因素，耐藥和腫瘤轉(zhuǎn)移是其不良預(yù)后的主要原因。因此研究腫瘤細(xì)胞的耐藥和轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)于提高患者預(yù)后生存率至關(guān)重要。研究表明，動(dòng)態(tài)生物學(xué)過程上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）通過將上皮腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)表型，從而可以增強(qiáng)腫瘤的耐藥性和轉(zhuǎn)移能力。而lncRNAs 是EMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并且高度參與N6-methyladenosine（m6A）加工的所有步驟。最新研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs MIR100HG，也被稱為miRNA的宿主基因（lnc-MIRHG），可以通過促進(jìn)RNA結(jié)合蛋白HuR與其靶向mRNA之間的相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，也是結(jié)直腸癌西妥昔單抗耐藥潛在標(biāo)志物。但其作用機(jī)制是否EMT過程以及是否由m6A介導(dǎo)參與等問題尚不清楚。

研究結(jié)果

1.  MIR100HG通過EMT過程影響CRC的耐藥和轉(zhuǎn)移

研究者首先通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，從人類細(xì)胞系HCA-7中產(chǎn)生西妥昔單抗敏感的CC細(xì)胞和耐藥的CC-CR細(xì)胞。并在3D培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)CC細(xì)胞呈現(xiàn)極化結(jié)構(gòu)，而CC-CR細(xì)胞則截然相反，失去頂基底極性表現(xiàn)出無組織結(jié)構(gòu)。接著通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)與CC細(xì)胞相比，CC-CR細(xì)胞的E-cadherin-mediated粘附連接缺失而EMT相關(guān)蛋白顯著增加，以上特征均表明在CC-CR細(xì)胞中發(fā)生EMT過程。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)與CC細(xì)胞相比，CC-CR細(xì)胞中MIR100HG是最顯著上調(diào)基因，并且在CRC公共數(shù)據(jù)集中（n=2375），MIR100HG和EMT通路富集評(píng)分高度正相關(guān)(R=0.764，P<0.0001)，并在高表達(dá)的CRC腫瘤組織中EMT-hallmark通路顯著富集。為了進(jìn)一步證明MIR100HG與EMT之間的作用關(guān)系，研究者通過基因敲除模型，發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)的MIR100HG CC細(xì)胞中E-鈣粘蛋白表達(dá)減少，間充質(zhì)基因和EMT-TFs表達(dá)增加。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，EMT過程是CRC耐藥和轉(zhuǎn)移的重要因素，并且MIR100HG表達(dá)在CRC中可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。

圖1. CRC中MIR100HG對(duì)EMT的調(diào)控

為了進(jìn)一步證明MIR100HG與CRC轉(zhuǎn)移和耐藥的關(guān)系，研究者首先在29個(gè)CRC細(xì)胞系上進(jìn)行西妥昔單抗藥物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在間充質(zhì)組細(xì)胞系（CMS4）上，表現(xiàn)出更明顯的耐藥反應(yīng)。基因敲除模型發(fā)現(xiàn)，敲除MIR100HG的CC-CR細(xì)胞（MIR100HGKOE4）菌落數(shù)目在西妥昔單抗藥物環(huán)境下顯著減少，而恢復(fù)全長(zhǎng)后則消除了對(duì)西妥昔單抗的敏感。為了確定上述結(jié)果是否可以在體內(nèi)重現(xiàn)，研究者通過熒光素酶和小鼠皮下注射體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在MIR100HGKOE4小鼠上熒光信號(hào)以及腫瘤體積和重量均顯著降低，并且免疫組化（IHC）染色也表明在MIR100HGKOE4腫瘤組織中含有較少的Ki-67陽性細(xì)胞和較多分裂的caspase-3陽性細(xì)胞。以上結(jié)果均證明MIR100HG對(duì)維持西妥昔單抗耐藥性和增強(qiáng)CRC腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力非常重要。

圖2.  MIR100HG促進(jìn)CRC細(xì)胞西妥昔單抗耐藥和轉(zhuǎn)移

2.  MIR100HG通過結(jié)合hnRNPA2BA并依賴m6A來調(diào)控TCF7L2穩(wěn)定性

研究表明，lncRNAs是通過與RNA結(jié)合蛋白的相互作用來進(jìn)行生物過程調(diào)控。研究者通過結(jié)合RNA純化（CHIP）和質(zhì)譜分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)hnRNPA2B1是MIR100HG最顯著的結(jié)合蛋白之一，并且該蛋白也是重要的EMT調(diào)控因子。接著通過RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證后，研究者使用RNAfold web server分析和生物素標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步確定了MIR100HG與hnRNPA2B1的具體結(jié)合區(qū)域。并通過基因敲除細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，hnRNPA2B1在CRC中有著與MIR100HG的相同作用，都可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的耐藥產(chǎn)生和遷移侵襲。

圖3.  hnRNPA2B1可以直接、功能性結(jié)合MIR100HG

然而，基因敲除模型發(fā)現(xiàn)MIR100HG的過表達(dá)或敲除均不影響CRC細(xì)胞中hnRNPA2B1的表達(dá)水平。鑒于hnRNPs與前體mRNA的加工和代謝相關(guān)，研究者通過在沉默MIR100HG/hnRNPA2B1后進(jìn)行RNA測(cè)序，結(jié)果找到TCF7L2基因是兩組差異分析結(jié)果當(dāng)中唯一一個(gè)均顯著下調(diào)的基因。并且過表達(dá)的TCF7L2可以阻止MIR100HG或hnRNPA2B1缺失CRC細(xì)胞的耐藥性和轉(zhuǎn)移作用。通過放線菌素D處理以及基因敲除模型，驗(yàn)證了MIR100HG與hnRNPA2B1的結(jié)合是穩(wěn)定TCF7L2 mRNA的關(guān)鍵因素。因?yàn)閔nRNPA2B1是核內(nèi)m6A依賴性的RNA加工介質(zhì)，而MeRIP分析表明TCF7L2 mRNA也是通過m6A修飾來增強(qiáng)其穩(wěn)定性的，因此研究者通過體內(nèi)RNA沉淀分析和熒光素酶報(bào)告技術(shù)證明了hnRNPA2B1與TCF7L2之間的相互作用是依賴于m6A的參與。最后，研究者使用基因敲除模型和TCF/LEF1熒光素酶報(bào)告，驗(yàn)證了MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2調(diào)控軸，并且該調(diào)控方式是通過Wnt通路作用來對(duì)CRC耐藥和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生作用。

圖4. MIR100HG和hnRNPA2B1協(xié)同調(diào)控TCF7L2的mRNA穩(wěn)定性并激活Wnt信號(hào)通路

3.  TCF7L2可激活MIR100HG轉(zhuǎn)錄形成正反饋調(diào)控回路

研究者通過JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)MIR100HG啟動(dòng)子有四個(gè)TCF7L2的結(jié)合位點(diǎn)，并通過細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)證明TCF7L2是MIR100HG轉(zhuǎn)錄的最重要調(diào)控因子。接著，研究者通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析證明TCF7L2也是激活MIR100HG轉(zhuǎn)錄的重要因子。并且在CRC細(xì)胞系以及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，TCF7L2和MIR100HG表達(dá)之間存在顯著正相關(guān)性。結(jié)果證明，MIR100HG和hnRNPA2B的相互結(jié)合可以增強(qiáng)TCF7L2mRNA的穩(wěn)定性，而TCF7L2通過轉(zhuǎn)錄激活又可以進(jìn)一步提高M(jìn)IR100HG豐度，形成一條MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2正反饋調(diào)控回路。

圖5. TCF7L2和MIR100HG在CRC細(xì)胞中形成正反饋回路

4.  CRC樣本中MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2的表達(dá)相關(guān)性 

最后，研究者從12對(duì)西妥昔單抗治療前和進(jìn)展中CRC患者上獲得腫瘤組織樣本，并進(jìn)行RNAscope染色和IHC染色，結(jié)果表明與治療前相比，西妥昔單抗治療進(jìn)展組中MIR100HG，hnRNPA2B和TCF7L2表達(dá)均顯著升高，并且三者之間存在明顯的正相關(guān)性。14對(duì)原發(fā)性結(jié)直腸癌組織、鄰近非腫瘤組織和匹配的淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移樣本的IHC染色結(jié)果同樣表明，在淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2表達(dá)顯著增加，并且也存在正相關(guān)關(guān)系。

圖6. MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2在CRC標(biāo)本中的協(xié)同表達(dá)

討論

該研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)合臨床患者自測(cè)數(shù)據(jù)及公共數(shù)據(jù)分析，在EMT依賴性結(jié)直腸癌西妥昔單抗耐藥和腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制上中揭示出一個(gè)新的MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2 正反饋調(diào)控回路。研究證明了MIR100HG與hnRNPA2B1相互作用是以m6A依賴的方式來介導(dǎo)TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定，而TCF7L2又可以激活MIR100HG的轉(zhuǎn)錄，從而形成正反饋調(diào)控回路。該發(fā)現(xiàn)有重要的潛在靶向治療應(yīng)用價(jià)值，有可能通過開發(fā)針對(duì)MIR100HG的靶向治療，來治療結(jié)直腸癌西妥昔單抗耐藥和轉(zhuǎn)移。而EMT在免疫抑制、免疫逃逸和免疫治療耐藥中也有關(guān)鍵作用。將MIR100HG的靶向干預(yù)與免疫檢查點(diǎn)抑制劑相結(jié)合可能是未來提高CRC患者免疫治療療效的潛在策略。 

END 

參考文獻(xiàn)：

[1]  Liu H, Li D, Sun L, Qin H, Fan A, Meng L, Graves-Deal R, Glass SE,Franklin JL, Liu Q, Wang J, Yeatman TJ, Guo H, Zong H, Jin S, Chen Z, Den g T,Fang Y, Li C, Karijolich J, Patton JG, Wang X, Nie Y, Fan D, Coffey RJ, Zhao X,Lu Y. Interaction of lncRNA MIR100HG with hnRNPA2B1 facilitates m6A -dependentstabilization of TCF7L2 mRNA and colorectal cancer progression. Mol Cancer.2022 Mar 12;21(1):74. doi: 10.1186/s12943-022-01555-3. PMID: 35279145; PMCID:PMC8917698.

撰寫丨阿暉

編輯、排版丨SX