轉自：空軍軍醫大學研究生院

導語

       空軍軍醫大學博士研究生劉浩在結直腸癌靶向治療耐藥研究領域取得突破性進展。研究成果以“lncRNA MIR100HG與hnRNPA2B1的相互作用促進TCF7L2 mRNA的m6A依賴性穩定和結直腸癌進展（Interaction of lncRNA MIR100HG with hnRNPA2B1 facilitates m6A-dependent stabilization of TCF7L2 mRNA and colorectal cancer progression）為題發表于《分子腫瘤學》（Mol Cancer，IF:27.4）。上述研究揭示了結直腸癌EGFR單抗治療耐藥的表觀遺傳學新機制，為臨床預測和逆轉EGFR單抗耐藥提供了新思路、新策略。研究受到了國家科技支撐計劃項目、國家自然科學基金優秀青年基金項目和國家自然科學基金面上項目等的資助。

研究背景

       分子靶向治療是目前腫瘤治療的新興領域，可極大提高晚期結直腸癌（colorectal cancer, CRC）患者的生存。西妥昔單抗 (cetuximab) 是靶向表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor， EGFR) 的治療性單抗，也是FDA和EMA批準用于治療KRAS/BRAF/NRAS 野生型晚期CRC的一線分子靶向藥物。但在臨床實踐中，大部分患者對西妥昔單抗的治療應答不超過 1 年，之后將發生獲得性耐藥，致病情進展。前期，本團隊建立了西妥昔單抗耐藥的三維 (three-dimensional，3D) 細胞模型，在體外和體內實驗中成功模擬了西妥昔單抗耐藥表型。發現MIR100HG基因第三個內含子所產生的miR-100/125b能靶向 Wnt通路中 5 個負性調控分子，從而促進 Wnt 通路活性增強，通過信號通路補償方式介導西妥昔單抗耐藥, 相關成果2017年以長文形式發表于Nature Medicine（IF:32.6）。但是，MIR100HG作為長鏈非編碼RNA本身能否夠獨立發揮作用，其具體機制尚不清楚。

最新成果

       本研究首次揭示了MIR100HG能以非miRNA依賴的方式促進結直腸癌細胞的上皮間質轉化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）, 西妥昔單抗耐藥和轉移等惡性表型。

其機制是，MIR100HG 與RNA結合蛋白核內不均一核糖核蛋白A2B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1，hnRNPA2B1）相互作用共同維持Wnt通路關鍵轉錄因子TCF7L2 (Transcription Factor 7 Like 2) mRNA的穩定性。并且hnRNPA2B1結合TCF7L2 mRNA依賴于其m6A 修飾識別功能和MIR100HG的分子支架作用。有意思的是，TCF7L2能直接轉錄激活MIR100HG的表達，從而構成了一個正反饋調控環路。更重要的是，在臨床結直腸癌西妥昔單抗治療前后樣本以及轉移樣本中MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2正反饋調控軸的存在得到了驗證，這為開發臨床預測和干預手段提供了理論支持。

要點一

圖1. MIR100HG促進了CRC西妥昔單抗耐藥過程中EMT的發生

       在3D培養條件下，西妥昔單抗耐藥細胞相對于敏感細胞呈現更明顯的間充質細胞表型，而上皮細胞表型減弱甚至消失，提示在西妥昔單抗耐藥過程中發生了EMT。隨后的生物信息學分析和功能實驗表明，MIR100HG與CRC的EMT密切相關，促進了EMT的發生。

要點二

圖2：hnRNPA2B1是MIR100HG的直接相互作用蛋白和功能效應分子

       通過ChIRP實驗聯合質譜分析以及RIP實驗明確了hnRNPA2B1是MIR100HG的直接相互作用蛋白。隨后的MIR100HG截短體 pull down實驗和hnRNPA2B1截短體RIP實驗確定了MIR100HG和hnRNPA2B1的相互作用區域。功能挽救實驗表明MIR100HG通過hnRNPA2B1發揮作用。

要點三

圖3. hnRNPA2B1結合TCF7L2 mRNA依賴于m6A修飾和MIR100HG

       meRIP實驗證實TCF7L2的mRNA存在m6A修飾，并且+2133位點是最主要的修飾位點。RIP實驗和S1m-tagged TCF7L2 pull down實驗證實TCF7L2 mRNA特定位點的m6A修飾是其被hnRNPA2B1結合的前提。雙熒光素酶報告基因實驗進一步明確hnRNPA2B1結合TCF7L2 mRNA依賴于m6A修飾和MIR100HG的協助。

要點四

圖4. MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2在CRC臨床樣本中的表達模式

       利用RNAscope®熒光原位雜交和免疫組織化學染色技術檢測CRC西妥昔單抗治療前后樣本和配對的癌旁、原發灶和淋巴結或遠處轉移灶組織中MIR100HG，hnRNPA2B1和TCF7L2的表達，發現MIR100HG, hnRNPA2B1和TCF7L2在西妥昔單抗治療后相較于治療前顯著升高，在轉移灶中的表達也明顯升高，并且MIR100HG和hnRNPA2B1與TCF7L2的表達呈顯著正相關。

作者心得

       本研究的創新性主要體現在以下兩個方面：

       一是聚焦臨床熱點問題，研究成果具有較好的轉化價值。目前，國際上關于抗EGFR靶向治療耐藥的研究大多集中在基因層面的改變，如獲得性KRAS/BRAF/NRAS 突變、EGFR突變、HER2、MET擴增等。據Nature報道，尚有17%的靶向藥耐藥患者，找不到具體的耐藥機制，且少有涉及表觀遺傳學水平改變的非突變機制報道。我們最近及之前的研究揭示了MIR100HG及其衍生的miR-100/125b調控的Wnt/β-catenin通路活性增強是導致結直腸癌患者EGFR單抗耐藥的重要原因。靶向Wnt/β-catenin通路聯合抗EGFR治療在臨床前模型中已展現出良好的治療效果，有望成功用于臨床。同時，通過液體活檢技術，動態監測MIR100HG以及miR-100/125b的水平，可能成為預測EGFR單抗耐藥的理想方式。

       二是運用前沿研究方法，深入剖析臨床現象背后的分子機制。本研究利用較為先進的3D細胞培養模型，相較于2D細胞模型，更貼近人體真實內環境，研究結果更具代表性。我們綜合運用ChIRP，RIP，RNA pull down，ChIP，meRIP和CRSPR/Cas9基因敲除等實驗方法，抽絲剝繭，層層深入，揭示了MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2這一正反饋調控軸的存在以及各分子之間的相互作用方式和機制，涉及到轉錄調控、轉錄后調控和表觀遺傳調控等多個方面。本研究涵蓋細胞水平、動物水平和臨床水平等多個維度，使得實驗結果和文章結論具有較高的可靠性。

專家點評

       劉浩的研究是我們團隊前期工作的延續，聚焦于靶向藥物耐藥的表觀遺傳學新機制。團隊在之前發表的Nature Medicine發現，MIR100HG來源的miR-100/125b通過靶向DKK1, DKK3, ZNRF3, RNF43 和APC2等5個負性調控分子促進Wnt通路，通過旁路激活途徑促進西妥昔單抗耐藥。本研究進一步發現lncRNA MIR100G通過與hnRNPA2B1結合，增加Wnt通路下游關鍵轉錄因子TCF7L2的mRNA的穩定性，從而激活Wnt通路。基于此研究結果，提出一種新的分子調控模式：MIR100HG和miR-100/125b分別通過作用于Wnt通路的不同水平協同激活Wnt通路活性，且這一模式在臨床樣本中得到證實。這一發現為臨床預測和逆轉靶向藥物耐藥提供了潛在靶點，具有很強的轉化應用前景。

原文速遞

Liu H, Li D, Sun L, et al. Interaction of lncRNA MIR100HG with hnRNPA2B1 facilitates m6A-dependent stabilization of TCF7L2 mRNA and colorectal cancer progression. Mol Cancer. 2022;21(1):74. Published 2022 Mar 12. doi:10.1186/s12943-022-01555-3

作   者：劉   浩

編   輯：姜小剛   馬鵬煒

審   核：韓興龍