發(fā)表時間：2021.11.23

通訊作者：曹海龍；Weilong Zhong；孫濤

通訊作者單位：天津醫(yī)科大學；南開大學

DOI號：10.1111/cas.15208

實驗設計

實驗設計圖 表1. 按飲食類別選擇的結直腸癌患者的基線特征。 

表2. 用于實時PCR的引物序列。

結果

1 高脂飲食加劇了結直腸癌患者的血管生成擬態(tài)形成和上皮-間充質轉化過程

越來越多的證據(jù)支持VM與HFD密切相關。一項隊列研究表明，有肝轉移的大腸癌患者血清低密度脂蛋白水平顯著高于無肝轉移的大腸癌患者。此外，HFD可增加小鼠結腸癌的血管生成和轉移。為了了解HFD與大腸癌進展之間的關系，我們研究了HFD對大腸癌患者VM和EMT的影響。我們發(fā)現(xiàn)患有HFD的CRC患者的VM通道陽性數(shù)明顯高于患有ND的CRC患者（圖1A）。

此外，免疫組織化學顯示HFD降低了E-鈣粘蛋白的表達水平，并提高了波形蛋白的表達（圖1B，C），波形蛋白分別作為上皮標記物和間充質標記物。這些結果表明HFD可能與大腸癌的EMT過程和VM形成密切相關。

圖1. 高脂肪飲食加劇了結直腸癌患者血管生成擬態(tài)的形成。A. CD34/PAS雙重染色用于識別血管生成擬態(tài)（VM）和內皮依賴性血管。黃色箭頭指向VM+通道（PAS正極和CD34負極通道）。標尺：50 μm。B和C，免疫組織化學染色用于區(qū)分ND和HFD組之間的EMT相關標記物（E-鈣粘蛋白和波形蛋白）。比例尺：100 μm。*P<0.01，***P<0.001。每組n=30。

2 高脂飲食改變了Apcmin/+小鼠腸道微生物群的組成和糞便膽汁酸譜

眾所周知，HFD可誘導小鼠腸道微生物群失調。為了確定ND組和HFD組腸道微生物組的變化，我們使用基于16S rRNA的高通量測序技術來確定小鼠糞便微生物組的組成。使用維恩圖確定不同組的唯一和共享OTU（圖2A）。HFD組有276個OTU，ND組有307個OTU，共有222個OTU。當使用主成分分析（PCA）分析兩組之間的差異時，各組的腸道微生物群組成顯示出明顯的聚集性，并不相似（圖2B）。

在門水平上，兩組之間的微生物群落組成不同。在HFD組中，厚壁菌和放線菌的相對豐度隨著擬桿菌的減少而升高，并且厚壁菌/擬桿菌的比率同時增加（圖2C）。然后，我們使用Chao指數(shù)揭示HFD喂養(yǎng)的小鼠與ND喂養(yǎng)的小鼠相比細菌豐富度較低（圖2D）。相似性分析（ANOSIM）和代表β多樣性的熱圖顯示兩組之間存在顯著差異（圖2E，F(xiàn)）。接下來，使用LEfSe分析來估計ND組和HFD組之間的差異豐富物種。患有HFD的小鼠有較高水平的機會性病原體，包括腸球菌、鏈球菌、Lachnoclostridium、Alistipes和Desulfovibrio。相反，與ND組相比，HFD組的有益細菌，如Candidatus Arthromitus、Marvinbryantia和Parasutterella相對較少（圖2G）。

為了研究HFD干預引起的糞便BAs的動態(tài)變化，采用液相色譜-質譜法對糞便中的BAs進行定量分析。如圖2H所示，HFD導致Apcmin/+小鼠的初級BAs不成比例增加，次級BAs明顯增加。尤其是HFD組的糞便DCA水平增加了600倍以上。我們通過Spearman相關分析進一步探討了BA譜與腸道微生物群組成之間的關系（圖2I）。有趣的是，Mucispirillum、Blautia、乳酸桿菌、副桿菌、腸球菌、大腸桿菌和鏈球菌與繼發(fā)性BAs（如DCA、wMCA、HDCA、LCA、TDCA、6-酮LCA和NorDCA）呈正相關，而與原發(fā)性BAs（如TUDCA、CDCA、CA、TaMCA和TbMCA）呈負相關。更重要的是，這些微生物屬具有形成膽鹽水解酶（BSH）的共同功能，該酶催化共軛初級BAs的水解。大多數(shù)這些微生物在HFD組更為豐富。

總之，這些數(shù)據(jù)表明HFD在調節(jié)腸道微生物群和干擾BA代謝方面具有重要意義。尤其是DCA是BA譜中最明顯的變化，這可能對HFD誘導的CRC的發(fā)生和發(fā)展有重要影響。

圖2. 高脂飲食改變了Apcmin/+小鼠腸道微生物群的組成和糞便膽汁酸譜。A. 維恩圖。B.  兩組糞便細菌的主成分分析（PCA）。C. 兩組在門水平上微生物群落組成的差異。D. Chao指數(shù)。E. 基于加權UniFrac距離的方差分析。F. 熱圖顯示出明顯的差異。G. 通過效應大小線性判別分析（LEfSe）生成的分支圖中差異豐富的物種。H. 檢測用ND或HFD治療的Apcmin/+小鼠的糞便膽汁酸（BAs）水平，表明HFD中的脫氧膽酸（DCA）顯著升高。I. 幾種顯著變化的糞便BAs與細菌屬之間的Spearman相關分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。ND，n=5；HFD，n=8。

3 高脂飲食誘導的微生物代謝產物脫氧膽酸加速Apcmin/+小鼠的癌變

進行了進一步的研究，以確定單獨使用DCA是否足以誘發(fā)HFD的類似效應（圖3A）。DCA治療后小鼠的生活狀態(tài)沒有差異，沒有一只小鼠死亡。在食物攝入量沒有差異的情況下，兩組的體重都逐漸增加，但沒有發(fā)現(xiàn)差異（P>0.05，圖3A）。DCA組小腸和結腸的平均腫瘤數(shù)量分別增加約1.6倍（11.10±0.90 vs 18.30±1.21，P<0.001）和2.6倍（0.70±0.26 vs 1.80±0.29，P<0.05）（圖3B）。

同時，與對照組相比，DCA組小腸各節(jié)段的腫瘤數(shù)量顯著增加（圖3C）。

此外，DCA組各種大小的腫瘤數(shù)量增加，主要是直徑為1-2 mm和>2 mm的腫瘤（1-2 mm:4.80±0.61 vs 8.00±0.77，P<0.01；>2 mm:1.10±0.31 vs 3.80±0.63，P<0.01，圖3D）。更重要的是，形態(tài)學顯示對照組僅觀察到少量散在的小息肉，而DCA組觀察到較大的腫瘤，尤其是結腸腫瘤（圖3E）。組織病理學上，在DCA治療的小鼠中，70%（7/10）被證實患有高度發(fā)育不良（HGD）或粘膜內癌，而對照組中只有20%（2/10）被認為患有HGD或粘膜內癌，另有40%（4/10）被發(fā)現(xiàn)患有低度發(fā)育不良（LGD；圖3F）。

總之，這些結果表明DCA可以促進腸道癌變。

 圖3. 脫氧膽酸加速Apcmin/+小鼠的腸腺瘤-腺癌序列。A. Apcmin/+小鼠飲用無菌水或含有0.2%DCA的無菌水12周的實驗流程圖。DCA組和對照組之間的體重沒有顯著差異。B. DCA組每只小鼠的腸道腫瘤總數(shù)增加。C 和D. 在DCA組中，近端、中部和遠端小腸腫瘤的數(shù)量和大小顯著增加。E. 兩組的小腸和結腸均顯示有代表性的腫瘤宏觀圖像。F. 他喜歡染色*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。每組n=10。

4 脫氧膽酸誘導Apcmin/+小鼠腸上皮細胞增殖和抑制凋亡

為了更好地了解DCA對腫瘤進展的影響，我們進一步檢測了腸道腫瘤組織中的增殖和凋亡。DCA組Ki-67陽性細胞的百分比顯著增加（28.12%±2.57% vs 51.9%±3.60%，P<0.001，圖4A）。同時，與對照組相比，通過TUNEL檢測，DCA組的凋亡細胞數(shù)量減少（15.90%±1.62% vs 9.20%±1.26%，P<0.01，圖4B）。DCA組的β-連環(huán)蛋白狀態(tài)也顯著增加，表明DCA可促進腫瘤細胞增殖（圖4C）。這些發(fā)現(xiàn)支持DCA促進增殖，減少細胞凋亡，并加速腸腺瘤向腺癌的轉變。

圖4. 脫氧膽酸促進Apcmin/+小鼠腸道腫瘤細胞增殖并減少其凋亡。A和B. 從每個切片中隨機選擇腫瘤組織，通過Ki-67和TUNEL染色計算陽性細胞的百分比。（C）免疫組織化學染色檢測β-catenin在腸道腫瘤中的表達。比例尺：50 μm。*P<0.01，***P<0.001。每組n=10。

5 脫氧膽酸驅動Apcmin/+小鼠的血管生成擬態(tài)形成和上皮-間充質轉化過程

在確認DCA可促進Apcmin/+小鼠腸道腫瘤的惡性進展后，我們研究了DCA與VM形成之間的關系，VM形成與腸道腫瘤進展密切相關。與對照組相比，DCA組有更多的VM通道，這些通道由腫瘤細胞而不是內皮細胞排列（圖5A）。VE鈣粘蛋白是一種跨膜蛋白，負責細胞間粘附，與VM的形成呈正相關。DCA處理在mRNA和蛋白質水平上增加了VE鈣粘蛋白（圖5B-D）。

與對照組相比，DCA顯著抑制上皮標記物（claudin-4和E-cadherin）的表達，并增加間充質標記物（波形蛋白和纖維連接蛋白；圖6A，B）的表達。EMT相關蛋白的表達，包括E-鈣粘蛋白和波形蛋白，也使用western blot分析進行檢測，結果與實時PCR相似（圖6C，D）。如圖6E所示，免疫組織化學染色顯示DCA降低了E-鈣粘蛋白的表達，增加了波形蛋白的表達，與上述分析一致。總的來說，這些結果表明DCA可以促進Apcmin/+小鼠的VM形成并誘導EMT。

圖5. 脫氧膽酸（DCA）驅動Apcmin/+小鼠的血管生成擬態(tài)形成。A. DCA組每個腫瘤組織的VM+通道數(shù)量顯著增加。n=10。B. 實時MPCR評估血管生成擬態(tài)（VM）相關標記物（血管內皮鈣粘蛋白[VE鈣粘蛋白]）的相對mRNA水平。n=5。C和D. VE鈣粘蛋白的western blot分析顯示DCA組的蛋白水平較高。n=4。標尺：50 μm。*P<0.05，**P<0.01。

圖6. 脫氧膽酸（DCA）誘導Apcmin/+小鼠上皮-間質轉化。A和B. 實時PCR分析顯示DCA分別下調上皮標記物（claudin-4和E-cadherin）和上調間充質標記物（波形蛋白和纖維連接蛋白）的表達。C和D. 波形蛋白在DCA組的表達高于對照組，而E-鈣粘蛋白的表達降低。n=4。E. 免疫組化分析；每組n=10。比例尺：50 μm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

6 脫氧膽酸加速HCT-116細胞的上皮-間質轉化過程、血管生成擬態(tài)形成和遷移

以一定的時間梯度（0、24、48、72和96 h）用不同濃度（0、20、50、100和200 μM）的DCA處理HCT-116細胞。CCK-8分析顯示，低濃度的DCA（<50μM）促進細胞增殖，但過高濃度的DCA可能由于毒性作用導致大量細胞壞死（圖7A）。DCA以濃度依賴和時間依賴的方式在HCT-116細胞中誘導EMT。特別是，用20 μM DCA處理HCT-116細胞24 h后，波形蛋白表達顯著升高，E-鈣粘蛋白表達水平顯著降低（圖7B，C）。然后我們從mRNA水平分析實驗結果，與western blot分析一致（圖7D）。利用體外建立的三維模型研究了DCA對HCT-116細胞VM形成的影響。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)20 μM DCA處理的HCT-116細胞形成了更典型和完整的血管樣管（圖7E）。此外，傷口愈合實驗證實，經(jīng)20 μM DCA處理的HCT-116細胞具有較高的遷移率和較窄的傷口面積，表明DCA促進了細胞遷移（圖7F）。

總之，DCA加速了HCT-116細胞的EMT過程、VM形成和遷移，從而使腫瘤細胞具有更多的侵襲性和表型。

圖7. 脫氧膽酸（DCA）加速HCT-116細胞的血管生成擬態(tài)形成、上皮-間充質轉化和遷移。A. 用細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）測定不同濃度和時間DCA處理HCT-116細胞的增殖能力。B和C. 在用DCA處理的HCT-116細胞中檢測波形蛋白和E-鈣粘蛋白的表達水平，以及濃度和時間變化。D. DCA處理的HCT-116細胞中上皮-間充質轉化（EMT）標記物的mRNA水平。E. 介紹了三維培養(yǎng)模型中血管樣管狀結構的圖像。在倒置顯微鏡下計數(shù)相應的圖案化網(wǎng)絡的數(shù)量。F. 傷口愈合實驗表明DCA加速了HCT-116細胞的遷移。對兩組傷口閉合的定量測量結果進行分析。比例尺：100 μm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。   

7 脫氧膽酸激活Apcmin/+小鼠的血管內皮生長因子受體2信號通路

血管內皮生長因子受體2在許多癌癥中過度表達，并參與轉移和復發(fā)。我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，DCA組VEGFR2的mRNA水平顯著升高；然而，未觀察到VEGFR1水平的顯著變化（圖8A）。考慮到EMT相關轉錄因子在EMT中的作用，我們還測量了腸道腫瘤組織中的ZEB1和ZEB2 mRNA水平，DCA處理的小鼠的水平顯著高于對照組（圖8A）。使用western blot分析，我們研究了VEGFR2的表達及其磷酸化指數(shù)，發(fā)現(xiàn)VEGFR2和p-VEGFR2在DCA組中過度表達（圖8B）。

免疫組織化學染色顯示，與對照組小鼠相比，DCA處理的小鼠在腸道腫瘤中表現(xiàn)出較高的p-VEGFR2表達（圖8C）。

 圖8. 脫氧膽酸（DCA）激活Apcmin/+小鼠的血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）信號通路。A. 在Apcmin/+小鼠中檢測VEGFR1、VEGFR2、ZEB1和ZEB2的mRNA表達水平。n=4-6。B. western blot分析檢測腸腫瘤組織中磷酸化VEGFR2和總VEGFR2的表達水平。n=4。C. 通過免疫組織化學染色評估p-VEGFR2在腸道腫瘤中的表達，n=10。標尺：50μm。*P<0.05，**P<0.01。

  8 血管內皮生長因子受體2的沉默影響脫氧膽酸誘導的HCT-116細胞上皮-間充質轉化過程、血管生成擬態(tài)形成和遷移

將血管內皮生長因子受體2 siRNA轉染HCT-116細胞，以對照siRNA作為對照，探討VEGFR2是否是DCA誘導的EMT和VM所必需的。通過westernblot分析確定轉染效率（圖9A）。由于VEGFR2轉染，DCA處理的HCT-116細胞中ZEB2 mRNA表達升高受到抑制（圖9B）。VEGFR2的缺失降低了DCA引起的E-鈣粘蛋白的表達并提高了波形蛋白的表達水平，突出了VEGFR2在DCA誘導的EMT過程中的關鍵作用（圖9C，D）。此外，如圖9E所示，VEGFR2基因敲除降低了DCA在基質HCT-116細胞中誘導的VM形成。同樣，與對照siRNA組相比，經(jīng)DCA處理的HCT-116細胞的遷移能力因VEGFR2下調而減弱（圖9F）。簡言之，這些發(fā)現(xiàn)表明VEGFR2對DCA誘導的EMT和VM形成至關重要。

圖9. 血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）沉默減弱脫氧膽酸誘導的HCT-116細胞血管生成擬態(tài)形成。A.  western blot檢測VEGFR2 siRNA和對照siRNA的轉染效果。B. 不同治療組的上皮-間充質轉化（EMT）相關轉錄因子（ZEB2）的mRNA水平。C和D. 在DMSO或20μM DCA條件下，評估經(jīng)VEGFR2 siRNA或cntrol siRNA處理的HCT-116細胞中EMT相關標記物（E-鈣粘蛋白和波形蛋白）的mRNA或蛋白質表達。E. 檢測VEGFR2沉默后HCT-116細胞典型血管樣管的形成能力。在倒置顯微鏡下顯示每張圖像中已完成的試管數(shù)量。F. VEGFR2基因敲除HCT-116細胞的傷口愈合試驗。顯示了傷口閉合的定量測量。比例尺：100 μm。*P<0.05，***P<0.001。

討論

先前的研究表明，VM是指侵襲性腫瘤細胞形成新生血管網(wǎng)絡，為快速生長的腫瘤提供潛在的灌注途徑，并增加臨床預后不良的風險。因此，可以進行進一步的研究，以探索影響VM形成的潛在致癌危險因素和相關機制。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HFD顯著促進結直腸癌患者VM的形成和EMT，提示飲食、VM和結直腸癌之間存在聯(lián)系。

研究表明HFD通過腸道微生物群失調和微生物群相關代謝物的改變促進結直腸腫瘤的發(fā)生。與此一致，我們發(fā)現(xiàn)HFD喂養(yǎng)的Apcmin/+小鼠表現(xiàn)出獨特的腸道微生物群組成和多樣性，這改變了胃腸道微生物衍生代謝物的產生。BAs是一類代表腸道微生物群與宿主共代謝的代謝物。長期食用HFD會導致BA代謝異常。正如我們的研究所表明的，BASHFD導致了不成比例的變化。Apcmin/+小鼠糞便DCA明顯增加。因此，HFD引起的糞便DCA水平升高可能與腸道腫瘤的進展有關。

與血管生成不同，VM是一種非內皮依賴性通道樣結構，內襯腫瘤細胞。過去，VM主要在高度侵襲性惡性腫瘤中報道，如黑色素瘤、膠質母細胞瘤、肝細胞癌和乳腺癌。最近，大腸癌中VM的形成在文獻中受到了更多的關注。傳統(tǒng)抗血管生成療法在患者生存率和療效方面沒有充分滿足臨床期望，部分原因是固有的和獲得性的治療耐藥性。更重要的是，腫瘤巧妙地部署了交替流動模式（VM），抗血管生成治療產生的缺氧微環(huán)境可能進一步加速VM的形成。基于該模型，VM可能成為腫瘤臨床治療的新靶點。例如，galunisertib是一種選擇性TGF-β受體激酶抑制劑，可以有效抑制VM的形成。據(jù)報道，48種R8修飾的表阿霉素雙氫青蒿素脂質體可有效抑制腫瘤的VM。顯然，微生物代謝物DCA在體外和體內是否能獨立促進腸癌變過程中VM的形成值得進一步研究。我們的研究首次直接證明了微生物代謝物DCA對腸癌變形成VM的影響。VM為腫瘤的臨床治療提供了新的視角。

由于DCA是促進腸道腫瘤VM形成的重要危險因素，因此有必要研究這種強烈刺激效應的具體分子機制。促進VM形成的機制非常復雜，其中EMT是研究最多的。EMT是一個動態(tài)去分化過程，上皮細胞失去其典型的上皮特征，如頂端-基底極性和細胞粘附，通過下調上皮基因和上調間充質基因獲得間充質細胞特征，如運動性和侵襲性。EMT參與生物學過程，如成人的胚胎發(fā)育、器官形成和組織再生，由于其在癌癥發(fā)展中的潛在作用，在過去二十年中受到了更多的關注。有趣的是，我們證明單獨使用HFD或DCA可導致上皮標記物的減少和間充質標記物的增加。EMT抑制劑（SB431542和U0126EtOH）明顯削弱了HCT-116和HCT-8細胞的VM形成能力，表明EMT過程對腸腫瘤VM的形成至關重要。因此，我們推測DCA通過促進EMT過程對VM的形成有積極的影響。與推測一致，我們證實DCA通過上調EMT相關蛋白的表達導致VM的形成。

脫氧膽酸似乎是血管內皮生長因子（VEGF）表達的強烈刺激物，這被證明是參與腫瘤轉移和血管生成的重要促血管生成因子。一項研究表明，VEGF的異常分泌與受體酪氨酸激酶結合，誘導受體二聚化和磷酸化，尤其是VEGFR1/2，導致內皮細胞再生、血管生成和腫瘤EMT的誘導。目前的研究主要集中在VEGFR2信號轉導與腫瘤血管生成之間的關系，而VEGFR2在VM形成中的重要作用被忽略。在本研究中，我們證明VEGFR2參與了DCA誘導的VM形成過程，為VM治療提供了重要靶點。索拉非尼是一種重要的抗VEGFR2藥物，已被證實對犬乳腺腫瘤的VM有抑制作用。然而，短期抗VEGF貝伐單抗治療可能通過誘導缺氧腫瘤微環(huán)境促進VM的形成，這可能在腫瘤侵襲和轉移中起關鍵作用。因此，VEGFR2信號通路的抑制劑有可能用于新的靶向藥物，以在最小化腫瘤微環(huán)境的負面影響和嚴格控制用藥時間的情況下阻斷腸腫瘤VM的形成。

總之，我們的結果表明HFD導致VM形成和腸道微生物群和BA代謝失調；DCA升高，促進了腸道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。更重要的是，DCA通過調制VEGFR2信號驅動EMT和VM形成（圖10）。總的來說，VM的形成為DCA復雜的致癌機制提供了新的理解，并且是個體化CRC治療的潛在治療靶點。然而，我們主要探討DCA在動物和細胞水平促進大腸癌的機制。至于臨床水平，關于血清DCA水平與人類CRC風險之間的關聯(lián)存在相互矛盾的數(shù)據(jù)，并且沒有明確的結論。

由于人類和小鼠在基因、生理結構、生化環(huán)境和腸道微生物群方面存在巨大差異，小鼠模型實驗的結果不足以解釋人類腸道菌群。

此外，由于樣本量小，研究方向受到限制。因此，微生物代謝物DCA在人類腸癌發(fā)生過程中促進血管生成擬態(tài)的形成有待進一步研究。

圖10. 微生物代謝物脫氧膽酸通過激活血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）信號，促進腸癌發(fā)生的血管生成擬態(tài)形成。該示意圖模型顯示了微生物代謝物DCA在誘導腸上皮腫瘤細胞血管生成擬態(tài)（VM）和上皮-間充質轉化（EMT）方面的作用。暴露于微生物代謝物DCA導致VEGFR2激活，從而導致上皮-間充質轉化（EMT）相關轉錄因子（ZEB1和ZEB2）表達增加，從而誘導EMT和VM形成以促進腸癌變。