結(jié)直腸癌是最多發(fā)的癌癥之一，病死率高居全球第二。

目前，利用患者腫瘤組織構(gòu)建的類器官模型已成為研究腫瘤發(fā)生分子機(jī)制的常用研究手段。多種腫瘤類器官已被成功構(gòu)建，包括結(jié)直腸癌，乳腺癌，膀胱癌，前列腺癌，胃癌等。然而，這些研究大部分僅在大量細(xì)胞系綜平均的水平評(píng)估了患者組織衍生的類器官的各種分子特征，如基因突變，基因組拷貝數(shù)變異以及基因表達(dá)等變化，并未在單細(xì)胞水平進(jìn)行評(píng)估，從而無(wú)法系統(tǒng)地評(píng)估構(gòu)建的類器官個(gè)體內(nèi)部的腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性情況，特別是由于構(gòu)建類器官的成功率常常不是很高，同時(shí)得到同一個(gè)患者的體內(nèi)腫瘤單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)以及在體外建成類器官后的配對(duì)單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)非常困難。   

為了系統(tǒng)地評(píng)估結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，解析類器官與對(duì)應(yīng)的體內(nèi)腫瘤上皮細(xì)胞之間的異同以及不同培養(yǎng)體系對(duì)類器官基因表達(dá)特征的影響，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）湯富酬團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)第三醫(yī)院普外科付衛(wèi)團(tuán)隊(duì)合作，對(duì)來(lái)自6名結(jié)直腸癌患者的體內(nèi)腫瘤組織和癌旁正常組織，以及對(duì)它們進(jìn)行體外培養(yǎng)建立的相應(yīng)的類器官進(jìn)行了高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并結(jié)合全基因組甲基化測(cè)序、全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序以及靶位點(diǎn)Sanger測(cè)序等對(duì)兩種常見(jiàn)結(jié)直腸類器官培養(yǎng)體系從轉(zhuǎn)錄組、基因組和DNA甲基化組三個(gè)層面進(jìn)行了系統(tǒng)的比較和評(píng)估（圖1）。該研究成果于2022年4月28日以“Systematic evaluation of colorectal cancer organoid system by single-cell RNA-Seq analysis”為題在線發(fā)表在Genome Biology上。 

圖1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案示意圖   

該研究有以下3個(gè)主要發(fā)現(xiàn)：

1. 腫瘤組織來(lái)源的類器官能準(zhǔn)確反映對(duì)應(yīng)體內(nèi)腫瘤上皮細(xì)胞（癌細(xì)胞）在基因表達(dá)、基因突變以及DNA甲基化等方面的關(guān)鍵特征。

通過(guò)探索體內(nèi)腫瘤特異性基因表達(dá)模式，該研究發(fā)現(xiàn)了腫瘤來(lái)源的類器官高表達(dá)體內(nèi)腫瘤上皮細(xì)胞（癌細(xì)胞）特異性表達(dá)的基因。并且，腫瘤組織來(lái)源的類器官也維持了體內(nèi)腫瘤上皮細(xì)胞特異性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)特征。另外，通過(guò)對(duì)全基因組(WGS)、全外顯子組(WES)、以及DNA甲基化組(PBAT)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，該研究發(fā)現(xiàn)腫瘤類器官能非常好地維持體內(nèi)腫瘤上皮細(xì)胞（癌細(xì)胞）在基因突變和DNA甲基化等方面的關(guān)鍵特征（圖2）。

這表明現(xiàn)有培養(yǎng)體系中的結(jié)直腸癌腫瘤類器官非常好地維持了對(duì)應(yīng)患者體內(nèi)癌細(xì)胞的關(guān)鍵生物學(xué)特征，因而使用腫瘤類器官篩選的癌癥治療候選藥物應(yīng)該對(duì)對(duì)應(yīng)患者體內(nèi)的癌細(xì)胞也會(huì)有類似的殺傷效果�，F(xiàn)有的腫瘤類器官是腫瘤殺傷藥物篩選的優(yōu)秀平臺(tái)。

圖2. 體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞和正常腸上皮細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)變異、DNA甲基化以及基因突變的比較

2. 癌旁正常組織來(lái)源的類器官在轉(zhuǎn)錄組水平上表現(xiàn)出部分腫瘤樣特征，但保持正常的基因組和全局DNA甲基化組特征。

首先該研究鑒定了體內(nèi)腫瘤上皮細(xì)胞和癌旁正常腸上皮細(xì)胞的差異表達(dá)基因，并研究了這些差異基因在體外腫瘤類器官和正常腸上皮類器官的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，體外正常腸上皮類器官和腫瘤類器官均高表達(dá)體內(nèi)腫瘤上皮細(xì)胞特異性表達(dá)的基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果，該研究對(duì)體內(nèi)組織和體外類器官進(jìn)行了腫瘤特異性表達(dá)基因CEACAM6的免疫熒光染色。與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，CEACAM6僅在體內(nèi)腫瘤上皮細(xì)胞中高表達(dá)，而在體內(nèi)癌旁正常腸上皮細(xì)胞中則不表達(dá)。然而，體外培養(yǎng)的腫瘤類器官和正常腸上皮類器官均高表達(dá)CEACAM6蛋白，此結(jié)果與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致（圖3）。 該研究的癌旁正常組織都取自距離腫瘤組織邊緣至少10厘米以外的區(qū)域，其正常組織內(nèi)部混雜大量腫瘤細(xì)胞的可能性非常低，但為了進(jìn)一步排除正常組織類器官有可能是混雜在癌旁正常組織中的腫瘤細(xì)胞體外擴(kuò)增而導(dǎo)致這一現(xiàn)象。該研究進(jìn)一步探究了體外腫瘤類器官和正常腸上皮類器官的基因突變和基因組拷貝數(shù)變異情況。結(jié)果顯示，只有腫瘤類器官呈現(xiàn)與對(duì)應(yīng)患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞相似的基因組拷貝數(shù)變異和基因突變，正常腸上皮類器官的基因組與體內(nèi)正常腸上皮細(xì)胞一致，沒(méi)有腫瘤細(xì)胞特異性的基因突變和基因組拷貝數(shù)變異，從而排除了正常組織類器官起源于癌旁正常組織中混雜部分腫瘤上皮細(xì)胞的可能性。以上數(shù)據(jù)顯示，在轉(zhuǎn)錄組和蛋白水平上，腫瘤上皮類器官和正常腸上皮類器官都表現(xiàn)出腫瘤樣特征。這表明現(xiàn)有的培養(yǎng)體系使得正常腸上皮類器官也具有部分腫瘤細(xì)胞特征，因而用同一個(gè)患者得到的腫瘤類器官和癌旁正常腸上皮類器官進(jìn)行配對(duì)藥物篩選、以篩選出特異性對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性殺傷效果（殺傷腫瘤類器官，但是不殺傷正常腸上皮類器官）的候選藥物目前是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

圖3. CEACAM6免疫染色熒光結(jié)果

3. 條件培養(yǎng)基在腫瘤類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)方面優(yōu)于化學(xué)成分確定培養(yǎng)基（分子培養(yǎng)基）。

首先，該研究通過(guò)MKI67的表達(dá)情況對(duì)不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞增殖情況進(jìn)行了評(píng)估（圖4）。在化學(xué)成分確定培養(yǎng)基（分子培養(yǎng)基）中，正常組織來(lái)源的類器官相比腫瘤來(lái)源的類器官具有更快的細(xì)胞增殖速度。在條件培養(yǎng)基中，正常組織來(lái)源的類器官和腫瘤來(lái)源的類器官的細(xì)胞增殖速度相當(dāng)。這說(shuō)明化學(xué)成分確定培養(yǎng)基（分子培養(yǎng)基）更有利于正常腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，而條件培養(yǎng)基對(duì)正常腸上皮細(xì)胞和腫瘤上皮細(xì)胞（癌細(xì)胞）的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯偏好性。而這一特點(diǎn)通過(guò)線粒體突變?cè)诓煌�培養(yǎng)基中培養(yǎng)的癌細(xì)胞的譜系追蹤得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖4. 體內(nèi)組織以及體外兩種培養(yǎng)基中的類器官細(xì)胞表達(dá)MKI67的比例   

此外，研究結(jié)果表明，條件培養(yǎng)基比化學(xué)成分確定培養(yǎng)基（分子培養(yǎng)基）更能真實(shí)地反映對(duì)應(yīng)體內(nèi)腫瘤上皮細(xì)胞（癌細(xì)胞）與正常腸上皮細(xì)胞的差異。與體內(nèi)相應(yīng)的癌細(xì)胞相似，在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的腫瘤類器官呈現(xiàn)腸上皮干祖細(xì)胞標(biāo)志基因OLFM4高表達(dá)和腸上皮分化成熟標(biāo)志基因CA2低表達(dá)的特征，正常組織類器官呈現(xiàn)相反的OLFM4低表達(dá)和CA2高表達(dá)的模式（圖5）。但在化學(xué)成分確定培養(yǎng)基（分子培養(yǎng)基）中，無(wú)論是正常組織類器官還是腫瘤類器官都具有相似的OLFM4高表達(dá)和CA2低表達(dá)的模式，無(wú)法準(zhǔn)確模擬對(duì)應(yīng)體內(nèi)不同類型上皮細(xì)胞基因表達(dá)的不同特征。

這表明現(xiàn)有的兩種培養(yǎng)體系對(duì)于維持對(duì)應(yīng)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞關(guān)鍵生物學(xué)特征都有效，但是條件培養(yǎng)基要優(yōu)于化學(xué)成分確定培養(yǎng)基（分子培養(yǎng)基），因而條件培養(yǎng)基是基于類器官的腫瘤發(fā)生分子機(jī)制研究和藥物篩選的首選培養(yǎng)體系。

圖5. 不同條件下的腫瘤細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞的CA2 和OLFM4的表達(dá)  

綜上所述，該項(xiàng)研究對(duì)結(jié)直腸癌體內(nèi)腫瘤組織、體內(nèi)癌旁正常組織、以及配對(duì)的在兩種不同培養(yǎng)體系中建立的腫瘤類器官、癌旁正常組織類器官進(jìn)行了高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，并結(jié)合全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序、DNA甲基化組測(cè)序以及靶位點(diǎn)Sanger 測(cè)序的結(jié)果，系統(tǒng)地評(píng)估了類器官模型在研究結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生分子機(jī)制上的可靠性和局限性。

該研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的培養(yǎng)體系中的腫瘤類器官非常好地維持了對(duì)應(yīng)結(jié)直腸癌患者體內(nèi)癌細(xì)胞的關(guān)鍵生物學(xué)特征，現(xiàn)有的腫瘤類器官是腫瘤發(fā)生分子機(jī)制研究以及腫瘤殺傷藥物篩選的優(yōu)越平臺(tái)�，F(xiàn)有的培養(yǎng)體系使得正常腸上皮類器官也具有部分腫瘤細(xì)胞特征，因而無(wú)法用同一個(gè)患者得到的腫瘤類器官和正常腸上皮類器官進(jìn)行配對(duì)篩選，以便得到對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性殺傷效果的候選藥物�，F(xiàn)有的兩種培養(yǎng)體系對(duì)于維持結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞關(guān)鍵生物學(xué)特征都有效，但是條件培養(yǎng)基要優(yōu)于化學(xué)成分確定培養(yǎng)基（分子培養(yǎng)基），因而條件培養(yǎng)基是結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生分子機(jī)制研究和藥物篩選的首選培養(yǎng)體系。

北京大學(xué)博士后汪睿、博士生毛雨諾、王維以及北京大學(xué)第三醫(yī)院普通外科周鑫主治醫(yī)生、王文東博士為該論文的并列第一作者。

北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心湯富酬教授和北京大學(xué)第三醫(yī)院普通外科付衛(wèi)教授為該論文的共同通訊作者。

該研究項(xiàng)目得到了國(guó)家自然科學(xué)基金和北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）的支持。