導語

m6A調控因子的表達異常和基因變化與惡性腫瘤進展和免疫調節異常相關。

  背景介紹 近年來，已經有越來越多的研究從m6A調控因子的角度出發研究癌癥的免疫相關信息，今天小編為大家帶來的這篇文章通過整合結腸癌（CC）樣本的數據，評估了m6A修飾模式與TME細胞浸潤特性的相關性。文章發表在《  Theranostics  》上，影響因子為11.556，文章題目為：  m6A regulator-based methylation modification patterns characterized by distinct tumor microenvironment immune profiles in colon cancer。

 數據介紹 CC樣本的基因表達數據和臨床特征回顧性收集于NCBI GEO數據庫和TCGA數據庫的公開數據集。 T CGA RNA測序數據(FPKM格式)從UCSC Xena 下載，并轉換為 TPM 格式。 TCGA-COAD的基因組突變數據(包括體細胞突變和拷貝數變異)來自UCSC Xena數據庫和Davoli等人 的 研究。

  結果解析 01   結腸癌中m6A調控因子的遺傳變異概況   在本研究中，作者研究了23個m6A RNA甲基化調控基因在CC中的作用，包括writers、readers、erasers。結果如圖1A所示，這些m6A調控因子的動態可逆過程可以識別、移除和添加m6A修飾位點，并改變大量的生物學過程，如RNA剪接、RNA翻譯和RNA降解。對23個m6A調控因子進行了GO富集和meta分析，顯著富集通路如圖1B所示。 測定了 CC中23個m6A調控因子體細胞突變的發生率 ，結果如圖1C-D所示， CN V突變普遍存在 ， 23個m6A調控子在染色體上的CNV改變位置如圖1E所示 。 接下來作者基于配對的腫瘤正常樣本進行主成分分析(PCA)，發現23個m6A調控因子完全區分了CC樣本和正常樣本(圖1F)。進一步分析顯示相關基因在腫瘤樣本中上下調差異顯著（圖1G）。

圖 1

02   23個調控因子介導的m6A甲基化修飾模式的鑒定   23個m6A調控因子之間的相互作用、調控因子連接及其在CC患者中的預后意義如圖2A所示，結果表明，“writers”、“readers”和“erasers”三個調控因子之間的交互作用可能在m6A不同修飾模式的形成中起著重要作用，并與腫瘤的發病和發展有關。因此作者采用NMF算法的共識聚類分析對從GEO獲得的癌癥樣本進行分層，共確定了三個不同的修正型聚集區（圖2B），分別命名為m6A-C1（221）、m6A-C2（530）和m6A-C3（162），其中m6A-C1生存最好，m6A-C3的預后最差。 接下來作者 對TCGA-COAD隊列進行了相同的分析，得到了相似的結果( 圖 2C )。

圖 2

03   m6A修飾模式具有明顯的免疫景觀特征   為了探究三種不同m6A修飾模式下的生物分子變化，作者對Hallmarker基因集進行了GSVA富集分析(圖2D)，結果顯示，m6A-C1在免疫激活相關過程中顯著富集，m6A-C3富集通路與致癌激活和基質通路顯著相關，m6A-C2在免疫調節和基質相關信號通路中都高度富集。 為可視化和比較不同m6A修飾模式下28個免疫浸潤細胞亞群的相對豐富度，作者使用ssGSEA構建了一張熱圖(圖3A)，發現抗腫瘤淋巴細胞亞群，如效應記憶CD4+/CD8+ T細胞，主要富集于m6A-C1和m6A-C2亞型，而在m6A-C3亞型中，調節性T細胞等明顯升高。作者還使用CIBERSORT進一步表征了免疫浸潤剖面，使用支持向量回歸評估TME中的免疫細胞子集，在m6A甲基化修飾分層中也觀察到了一致的結果(圖3B)。

圖 3

接下來，作者使用ESTIMATE算法來量化三種修飾模式的整體免疫細胞浸潤(immune Score)和腫瘤細胞純度(tumor purity)，結果顯示，m6A-C1的免疫評分最高，其次是m6A-C2和m6A-C3(圖3C，上圖)。相反，m6A-C3的腫瘤純度高于m6A-C2和m6A-C1，說明m6A-C2和m6A-C1亞型腫瘤被更多的非腫瘤成分(如免疫細胞和基質細胞)包圍(圖3C，下圖)。 目前有研究將CC患者分為4個主要分子亞型(CIN、CSC、dMMR和KRASm)，本研究發現CIN亞型主要集中在m6A-C2和m6A-C3，而dMMR亞型主要集中在m6A-C1腫瘤內(圖3D)。已知PD-L1是預測抗PD-1/L1治療反應的成熟生物標志物，作者還比較了不同m6A修飾簇中PD-L1的表達水平，發現在m6A- c1亞型顯著上調(圖3E)。以上結果證實了這三種m6A修飾模式具有不同的免疫浸潤特征。 04   結腸癌中m6A表型相關的DEGs   為了研究3種m6A修飾表型中潛在的基因改變和表達擾動，本研究進一步研究了CC中三種m6A修飾模式中可能存在的m6A相關轉錄表達變化，應用經驗貝葉斯方法確定了三種m6A修飾模式之間的重疊差異表達基因(DEGs)（圖4A）。 對這些特征基因的GO富集分析顯示，與RNA修飾、轉錄和免疫調節相關的生物過程顯著富集(圖4B)。

圖 4

基于524個最具代表性的m6A表型相關標記基因，作者進行了無監督一致性聚類分析，獲得了3個穩定的轉錄組表型。這些分層將患者分為三個不同的m6A基因標記亞組，具有不同的臨床病理特征，并被定義為m6A基因- s1、m6A基因- s2和m6A基因- s3(圖4C)，作者發現臨床晚期患者以m6A基因-S3亞組為代表，CIN亞型和PD-L1表達下調的患者主要集中在m6A基因- s2和S3亞組。接下來作者進行了生存分析，m6A基因- s1標記被證明與較好的預后相關，而m6A基因- s3與較差的生存結果相關(圖4D)，考慮年齡、性別、MMR和分期后，m6A基因標記與生存率之間的相關性仍具有統計學意義（圖4E）。   05   m6Sig評分的構建及其臨床相關性的探討   為了準確預測單個腫瘤中m6A甲基化修飾的模式，作者開發了一個評分方案，稱為m6Sig評分，該評分方案基于已識別的m6A相關標記基因，以量化單個CC患者的m6A修飾模式，使用桑基圖(圖5A)說明了m6Sig評分構建的工作流程。作者通過Spearman分析檢驗了已知生物特征和m6Sig得分之間的關系。相關矩陣的熱圖顯示，m6Sig評分與免疫激活過程和DNA修復簽名顯著負相關，但與EMT和基質相關簽名正相關(圖5B)。 此外，作者還確定m6Sig評分在預測生存結局方面的預后能力，結果顯示低m6Sig分數患者有更好的預后顯著相關CIT隊列(圖5C)。并且作者探索了m6Sig評分與分子亞型之間的關系，發現dMMR亞型與m6Sig評分低于其他CC亞型(圖5D)。PD-L1的表達水平，在m6Sig低評分組也被發現有明顯的升高(圖5E)。

圖 5

結合TCGA-COAD數據庫的臨床特征和基因組信息，作者對構建的m6A評分系統進行驗證。研究發現，m6Sig評分在TCGA隊列中具有潛在的預后預測價值，m6Sig評分低的患者具有顯著的生存獲益（圖5F)。TCGA分析顯示了CC的綜合分子特征，并建議根據MSI狀態將腫瘤細分為4個亞型。MSI-H亞型樣本的m6Sig評分顯著低于其他三種亞型樣本(圖5G)。

圖 5

越來越多的證據表明，腫瘤基因組體細胞突變和免疫治療反應之間的聯系。因此作者研究了腫瘤突變負荷在不同m6Sig評分組中的分布規律，發現m6Sig評分低的組突變頻率更高(圖5H)。作者發現在m6Sig低得分亞組中，體細胞拷貝數改變(SCNA)的頻率更高，即SCNA與免疫逃避和腫瘤細胞增殖呈正相關(圖5I)。作者進一步對CC樣本中m6Sig低分組和高分組進行了顯著突變基因(SMG)分析。SMG突變圖譜顯示，PIK3CA和SMAD4在m6Sig低評分組中有較高的體細胞突變率，而TP53在m6Sig高評分亞型中有較高的體細胞突變率(圖5J)。為了進一步了解在CC中起作用的突變過程，作者從TCGA-COAD突變譜中提取了三個突變標記（1,6,10），結果發現，m6Sig低得分亞型具有顯著更高比例的突變特征6 (圖5J)。 06   m6Sig評分在預測免疫治療益處中的作用   免疫治療無疑是抗腫瘤治療的重大突破，作者發現，TIDE在m6Sig低評分組中顯著降低，而IPS在m6Sig低評分組中顯著升高(TIDE在TCGA-COAD和CIT中的分布，圖6A-B;IPS在TCGA-COAD和CIT中的分布，圖6C-D)。這些發現間接證明腫瘤m6A修飾模式的表達在介導免疫應答中起著至關重要的作用。 由于m6Sig評分與免疫反應的強相關性，作者研究了m6A修飾標記是否可以預測三個獨立免疫治療隊列中患者對ICI治療的反應。 結果發現，在抗PD1隊列和抗CTLA4隊列中，m6Sig低評分組患者表現出顯著的臨床優勢和顯著延長生存期( 抗PD-1, 圖6E，抗CTLA-4, 圖6G)。 與m6Sig評分高的患者相比，m6Sig評分低的患者證實了ICI治療的顯著治療效益和免疫應答(抗PD-1，圖6F；抗CTLA-4，圖6H)。研究結果證明，m6Sig評分與免疫治療的反應有關，可以進一步預測患者的預后。

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  小編總結 在本研究中，作者發現了三種不同的m6A甲基化修飾模式，它們以不同的免疫表型為特征，與不同的抗癌免疫相關，還建立了一個名為“m6Sig評分”的量化系統來定義不同的m6A修飾模式，從而更精確地指導個體患者的治療策略。