編譯：微科盟藍胖兒，編輯：微科盟木木夕、江舜堯。
微科盟原創微文，歡迎轉發轉載。
導讀 在過去的幾年里，人們對利用天然生物活性成分的開發治療人類疾病的方法越來越感興趣。將食用菌杏鮑菇的粉末與患有C26結腸癌的小鼠的正常飲食混合。C26荷瘤小鼠存活率的顯著提高以及腫瘤中Hsp90和Hsp27蛋白水平的顯著提高。這些數據與Hsp60水平的下降相一致。飲食中引入的杏鮑菇抑制了促炎細胞因子IL-6和IL-1的轉錄，發揮抗炎作用。杏鮑菇的作用是由c-Jun NH2末端激酶的激活介導的，這是由飲食中引入的微量營養素引起的代謝應激的結果。在添加杏鮑菇粉飼養的C26荷瘤小鼠的腫瘤中，有絲分裂調節因子survivin和抗凋亡因子Bcl-xL的表達減少，驅動自噬的蛋白Atg7的表達水平增加。在本研究的假設中，這些分子的相互作用有利于添加杏鮑菇粉飼養小鼠的存活。這些數據為杏鮑菇作為膳食補充劑或作為抗癌治療的佐劑的引入提供了希望。
原名：JNK pathway and heat shock response mediate the survival of C26 colon carcinoma bearing mice fed with the mushroom Pleurotus eryngii var. eryngii without affecting tumor growth or cachexia
譯名：JNK途徑和熱休克反應介導以杏鮑菇為食的C26結腸癌小鼠的存活，而不影響腫瘤生長或惡病質
期刊：Food & Function
IF：4.171
發表時間：2021.2
通訊作者：Antonella Marino Gammazza
通訊作者單位：意大利巴勒莫大學生物醫學、神經科學和高級診斷學系
首先在小鼠的飲食中添加杏鮑菇粉，由于老鼠每天的飼料攝取量約為其體重的15%，我們在飲食中添加了6.67%的杏鮑菇粉。將120.06 g杏鮑菇粉加入到1679.94 g普通飼料粉中，攪拌均勻配制成含杏鮑菇粉的綜合飼料。杏鮑菇粉的營養價值見表1。 
然后建立動物模型，用30只C26荷瘤小鼠研究動物模型的存活情況。在腫瘤植入前10天和直到它們死亡之前用凍干 杏鮑菇粉 和正常小鼠飲食的混合物喂養，每天用喂養4克混合物（n = 15）。用正常飲食飼養的小鼠作為對照組（n = 15）。此外，10只C26荷瘤小鼠（n = 5添加杏鮑菇粉和n = 5正常飲食）用于獲得用于形態學和分子檢查的樣品。在小鼠體重下降15%（惡病質）的當天，通過頸椎脫臼處死這些小鼠。腫瘤被切除并分成兩部分。將一半的C26腫瘤固定在含有丙酮、甲醇和水（2:2:1）的緩沖液中12小時，然后包埋在石蠟中，而其余部分在液氮中冷凍并儲存在80℃。福爾馬林固定的腫瘤樣品（每組5個）被包埋在石蠟中，并切成5 μm的切片。切片用蘇木精和伊紅染色進行組織學評價。然后進行了免疫熒光分析、免疫組織化學分析和蛋白印記分析。最后進行了熒光實時定量PCR分析，使用表2中給出的引物擴增cDNA。采用2-ΔΔCT法計算轉錄水平的變化。
表2 qRT-PCR所用引物
每天用分析天平檢查小鼠的體重，通過觸診監測腫瘤生長（表3，腫瘤生長延遲）。如表3所示，在實驗組中，惡病質發作有輕微但不顯著的延遲（以天為單位）。與對照組相比，添加杏鮑菇粉飼養的小鼠存活率顯著增加（p = 0.0495，圖1）。對照組接種腫瘤后的平均存活時間為35.5天，添加杏鮑菇粉飼養組的平均存活時間延長至41.5天。
圖 1 C26荷瘤小鼠存活率。Log-rank檢驗表明，與對照組相比， 添加杏鮑菇粉 飼養可提高C26小鼠的存活率（p = 0.0495，n = 15/組）。
取10只C26荷瘤小鼠（n = 5添加杏鮑菇粉，n = 5正常飲食），在繪制存活率結果后進行處理，用于形態學和分子檢測。這些動物的體重、脾臟重量和腫瘤重量有輕微但不明顯的下降（表4）。宏觀上看，腫瘤呈結節狀，半透明，被包膜，易于與周圍組織分離（圖2a）。用蘇木精和伊紅染色對其進行組織學評價顯示高度細胞新生，由小的、圓形或橢圓形細胞組成，細胞質極少，細胞核有核仁。觀察到罕見的假腺結構（圖2b）和一些有絲分裂圖（黃色箭頭，圖2c）。
圖2 C26腫瘤的形態學和組織學特征。（a）新鮮切除腫瘤的代表性圖像顯示為結節狀，半透明，有包膜，容易與周圍組織分離。（b）蘇木精和伊紅染色的代表性圖像。可見浸沒在間變性細胞中的假腺結構。（c）蘇木精和伊紅染色的代表性圖像。黃色箭頭表示存在一些有絲分裂像，表明即使在 添加杏鮑菇粉飼養 后腫瘤仍有增殖活性。JNK蛋白及其相關分子在正常飲食飼養小鼠和添加杏鮑菇粉飼養小鼠腫瘤腫塊中的表達。JNK染色在兩個組中均升高，并在細胞質和細胞核中觀察到。陽性細胞的平均百分比在正常飲食飼養組為89.5%，在添加杏鮑菇粉飼養組為87.1%，無顯著差異（圖3a和b）。p-JNK免疫組化分析顯示有核信號，陽性細胞的平均百分比在正常飲食飼養組為18.2%，在 添加杏鮑菇粉飼養組 為38.5%。統計學分析顯示添加杏鮑菇粉飼養組p-JNK表達明顯高于正常飲食飼養組（p < 0.05）（圖3c和d）。Bcl-xL信號是細胞質信號。Bcl-xL染色陽性細胞的百分比在正常飲食飼養組為69.5%，在組為38.4%，差異顯著（p < 0.001）（圖4a和b）。此外，Survivin染色為細胞質染色，陽性細胞的平均百分比在正常飲食飼養組為29.9%，在添加杏鮑菇粉飼養組為9.6%，差異顯著（p < 0.001)（圖4c和d）。最后，進一步分析腫瘤中是否存在Atg7作為自噬的標記物。如圖3e和f所示，與正常飲食飼養組相比添加杏鮑菇粉飼養組Atg7表達顯著增加（陽性細胞的平均百分比分別為9.9%和3.6%，p < 0.0001）。Atg7呈細胞質免疫陽性。
圖3 JNK、p-JNK和Atg7的免疫組織化學結果。（a）JNK（c）p-JNK和（e）Atg7在在 正常飲食飼養小鼠和添加杏鮑菇粉飼養小鼠 腫瘤組織中的代表性圖像。黃色箭頭表示存在一些有絲分裂像，表明即使在添加杏鮑菇粉飼養后腫瘤仍有增殖活性。（b）JNK的免疫陽性百分比、（d）p-JNK的核陽性百分比和（f）Atg7的細胞質陽性百分比。
圖4 Bcl-xL和survivin免疫組化結果。（a）Bcl-xL和（b）Survivin在正常飲食飼養小鼠和添加杏鮑菇粉飼養小鼠腫瘤組織中的代表性圖像。（c）Bcl-xL免疫陽性百分比和（d）Survivin細胞質陽性百分比。4 添加杏鮑菇粉飼養 對腫瘤中Hsp90、Hsp70、Hsp60和Hsp27蛋白水平的影響蛋白質印跡分析和免疫熒光法用于測定Hsp90、Hsp70、Hsp60和Hsp27蛋白水平。如圖5a所示， 添加杏鮑菇粉飼養 顯著增加了腫瘤中的Hsp90和Hsp27蛋白水平（分別為p = 0.0350和p = 0.0400），而Hsp60蛋白水平顯著降低（p =0.0159）。相反，兩組間關于Hsp70蛋白水平的差異并不顯著。使用免疫熒光進行的觀察證實了添加杏鮑菇粉飼養影響Hsp90、Hsp60和Hsp27蛋白水平（圖5b）。關于這些蛋白質的細胞位置，在各組之間沒有觀察到差異。Hsp90和Hsp27的優先位置似乎是細胞質，而Hsp60位于類似線粒體的小點上。
圖5 C26腫瘤中Hsp90、Hsp70、Hsp60和Hsp27蛋白表達水平。（a）在添加杏鮑菇飼養的小鼠的腫瘤中，誘導了Hsp90和Hsp27蛋白水平的升高和Hsp60蛋白水平的降低。β-肌動蛋白用作內參。（b）使用免疫熒光檢測Hsp90、Hsp60和Hsp27時采集的代表性圖像。細胞核用Hoechst 33342復染。使用共聚焦顯微鏡的觀察證實了通過蛋白質印跡分析獲得的數據。5 添加杏鮑菇粉飼養對腫瘤組織中IL-6、IL-1和TNFα mRNA表達水平的影響為了更好地評價添加杏鮑菇粉飼養對腫瘤的影響，采用qRT-PCR檢測IL-6、IL-1和TNFα的mRNA表達水平。如圖6所示，添加杏鮑菇粉飼養導致IL-6和IL-1表達水平顯著下調（p = 0.0001和p = 0.0100），而TNFα表達水平沒有改變。
圖 6 C26腫瘤中IL-6、IL-1和TNFα基因表達水平。添加杏鮑菇粉飼養小鼠C26腫瘤中IL-6和IL-1基因表達水平的下調。條形圖顯示IL-6、IL-1和TNFα基因表達水平歸一化到參照基因（GAPDH），根據Livak方法（2-ΔΔCT）。在本研究中，使用結腸癌和癌癥惡病質的異位模型研究了添加杏鮑菇粉飼養的效果。異位腫瘤模型（皮下腫瘤）在文獻中被大量使用，因為它們具有易于監測腫瘤進展和評估治療干預方面具有優勢。結果顯示，添加杏鮑菇粉飼養的C26結腸癌小鼠比喂食正常飲食的小鼠存活時間更長。此外，這些動物的惡病質發病沒有明顯的延遲，腫瘤重量也沒有明顯的減少。對移植腫瘤的分子和組織學分析顯示，Hsp90、Hsp60和Hsp27蛋白水平發生了顯著的改變。這些蛋白在所有組織中都有生理表達，但它們可以被應激信號機制誘導，從而觸發細胞凋亡、腫瘤增殖和化學抗性。在添加杏鮑菇粉飼養的C26荷瘤小鼠的腫瘤中，觀察到Hsp90和Hsp27蛋白水平增加，同時Hsp60水平降低。Hsp90的表達增加與肺癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤和白血病的預后不良有關。關于結腸癌， Hsp90的高水平反映了較低的惡性潛能。腫瘤Hsp90高水平的患者比陰性或低表達腫瘤的患者具有更好的存活率。這一發現可以部分解釋添加杏鮑菇分別飼養的C26荷瘤小鼠比用正常飲食喂養的小鼠存活時間長。Hsp27在胃癌、前列腺癌、胰腺癌和預后不良的多種腫瘤中均有高水平的組成性表達。在本研究的模型中，Hsp27水平的增加應該被認為是癌細胞試圖克服可能由飲食中添加杏鮑菇分粉引起的代謝改變所引起的應激。 添加杏鮑菇粉飼養 的小鼠腫瘤中Hsp60水平的降低是通過補充杏鮑菇中所含的微量營養素對惡性腫瘤的保護作用的結果。在移植的腫瘤中觀察到的IL-6和IL-1基因表達水平的顯著降低。IL-1和IL-6是參與維持腫瘤生長所需的細胞因子，特別是在腫瘤微環境中驅動炎癥。IL-1和IL-6與促進血管生成、癌細胞的存活、轉移和治療抗性有關。這些細胞因子是包括結腸癌在內的不同類型癌癥發生的標志。這些數據導致了一種假說，即它們在添加杏鮑菇粉飼養小鼠的腫瘤中表達的下調，由杏鮑菇誘導的一種強大的抗炎作用信號，這種作用同時對抗了癌癥的侵襲性，有利于實驗動物的生存。為了確定添加杏鮑菇粉飼養觀察到的效應中涉及的可能機制，分析了JNK轉導通路，因為它涉及不同的生理機制，包括細胞存活和死亡。添加杏鮑菇粉飼養小鼠的腫瘤顯示對p-JNK的免疫反應性增加，對生存素和BcL-xL的免疫反應性降低。在提出的工作假設（圖7）中，補充維生素、微量元素和礦物質后，飲食中的杏鮑菇粉通過磷酸化誘導JNK激活。
圖7 工作假設。在飲食中添加杏鮑菇粉可誘導JNK途徑的激活，以響應維生素、微量營養素和礦物質的補充（圖中的灰點）。通過磷酸化激活JNK（p-JNK）可能誘導HSF1激活，引發熱休克反應。Hsp90和Hsp27水平的增加可以被認為是癌細胞克服由代謝變化引起的壓力的一種嘗試。Hsp60蛋白水平顯著降低，Hsp60蛋白水平降低也可能與survivin的降低有關。Survivin的減少與Atg7的升高有關，Atg 7是自噬的標志。另一方面，p-JNK最常見的活性是誘導c-Jun磷酸化，這可以抑制促炎細胞因子IL-6和IL-1的轉錄（Hsp60也在這種抑制中起作用）。IL-6和IL-1表達的下調可能與它們在癌癥微環境中水平的降低平行。這種情況與營養攝入可能導致的代謝轉換有關，可能有助于提高實驗動物的癌癥生存率。C-Jun可激活抗凋亡因子Bcl-xL的降解，Bcl-Xl是凋亡和自噬之間相互作用的調節劑。Atg7的升高和survivin水平的不穩定以及Bcl-xL的降低導致了自噬的恢復，這可能是飲食改變的結果，最終干擾了小鼠的存活率。本研究的結果表明，添加杏鮑菇粉飼養效應可能是由 JNK 激活驅動的多種細胞機制介導的。一方面， p-JNK 觸發熱休克反應， survivin 下調，上調 Atg7 。此外， p-JNK 可誘導 IL-6 、 IL-1 、 Bcl-xL 下調，具有抗炎、促凋亡作用。 Atg7 的升高和 survivin 的不穩定以及 Bcl-xL 水平的降低有助于自噬的恢復，這可能是飲食改變的結果，最終干擾了實驗小鼠的存活率。這可能是首次將杏鮑菇膳食補充劑、 p-JNK 、應激蛋白和炎癥細胞因子之間建立了關系。從而影響癌癥小鼠的生存。研究的分子可以作為有前途的生物標記物，用于進一步研究杏鮑菇作為膳食補充或作為抗癌治療的輔助劑。
