編譯：微科盟一山，編輯：微科盟木木夕、江舜堯。

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所研究人群的平均年齡為59歲(標準差為8歲)，51%的參與者是女性。抽血到診斷的中位數時間為3.4年，范圍在0到8.5年之間。患者往往比對照組更有可能肥胖(BMI≥30kg/m²)(分別為21%和16%)，以前或現在吸煙者(分別為59%和52%)。腸癌患者組相對于對照組有較高的每日能量攝入量(平均分別為2173 kcal和2052kcal)(表1)。

我們分別檢測了對E.coli和ETBF蛋白的IgA和IgG抗體反應，并比較了持續熒光強度在病例和對照組之間的反應水平(圖1)。這項分析是在血清陽性病例和對照中進行的，因為一些抗原的抗體水平大多低于檢測的技術極限。病例組與對照組抗體水平差異無統計學意義(P>0.05)。因此，在這項研究中，我們決定不更詳細地分析抗體反應水平，而是將重點放在血清陽性上，作為一種更可靠的衡量標準。

應用血清陽性界值(表2)將42%的對照組定義為對任何E.coli蛋白IgA陽性，相比之下，49%的病例為IgA陽性(表3)。這一差異具有統計學意義，粗略模型中大腸癌的OR值為1.37(95%CI：1.04，1.8；p值=0.024)，多變量調整模型1的OR值為1.35(95%CI：1.02，1.79，p值=0.035)，多變量調整后的模型2調整飲食變量和體力活動后的OR值為1.42(95%CI：1.05，1.91；p值=0.022)。然而，經FDR調整后的值沒有保持顯著性，相應的Q值分別為0.096、0.118和0.088。鑒于p值是從一種明確的假設驅動的方法中得出的，通過對兩種細菌進行少量的比較，我們的解釋基于觀察到的p值，并將q值作為一個保守的平衡。

對任何E.coli蛋白IgG呈陽性反應(對照：64%，腸癌病例69%)或對任何BFT亞型IgA或IgG呈陽性反應(IgA：對照，5%，腸癌病例6%；IgG：對照，11%，腸癌病例14%)之間差異無統計學意義。在被評估的單個E.coli蛋白中，對照組中ClbM的抗體應答率最低(IgA：0%和IgG：3%)，Ag43的抗體應答率最高(IgA：16%和IgG：31%)。對于ETBF，兩種亞型的抗體應答率相似(BFT-1：IgA，4%和IgG：6%；BFT-2：IgA：2%和IgG：9%)。E.coli Ag43蛋白IgA陽性(OR：1.55；95%CI：1.08，2.21)和ETBF毒素BFT-1IgG陽性(OR：1.80；95%CI：1.06，3.04)與大腸癌的發生有關。

我們進一步評估了對E.coli或ETBF蛋白或其組合的IgA或IgG陽性，與結腸癌主要解剖近端或遠端亞部位發生癌癥的幾率更高相關(表4)。對任何E.coli蛋白、任何ETBF蛋白均呈IgA和IgG陽性，且對這兩種蛋白均呈雙重陽性的近端結腸癌比遠端結腸癌更常見(表4)。此外，E.coli蛋白或ETBF蛋白的IgG陽性反應以及E.coli和ETBF的雙重IgG陽性反應與發生近端結腸癌的風險顯著相關(分別為OR：2.12；95%CI：1.20，3.76，OR：1.87；95%CI：1.04，3.34；OR：2.75；95%CI：1.16，6.50)，但與遠端結腸癌的發生無統計學意義(OR：2.12；95%CI：1.20，3.76；OR：1.87；95%CI：1.16，6.50)。然而，異質性的p值并不表明不同站點之間存在統計學上的顯著差異(分別為0.093和0.095)。

E.coli的IgA/IgG雙重陽性與單獨檢測IgA相比，發生大腸癌的幾率更高(OR：1.57；95%CI：1.07，2.32)，而兩種細菌的聯合陽性與單個Ig類大腸癌的發生相似(盡管不顯著)。然而，這些分析的范圍有限，因為對ETBF的雙重肯定的數量很少(補充表S2)。

在對目前歐洲前瞻性隊列中的大腸癌病例對照研究中，我們觀察到，對涉及生物膜形成和大腸桿菌素分泌的E.coli蛋白以及對ETBF毒素的抗體陽性反應與發生大腸癌的幾率有較高相關性。具體地說，E.coli和ETBF的IgG雙重陽性反應提高1.79倍的大腸癌發病幾率和2.75倍的近端結腸癌癥發病幾率。雖然這些發現在FDR多重檢驗校正后沒有保持顯著性，但我們認為這種校正過于嚴格，因為我們所有的分析都是根據我們的既定假設預先計劃的，相關測試的抗原數量并不多。

據我們所知，這是第一項評估E.coli和ETBF與發生大腸癌幾率之間關系的血清學研究。此前的研究主要集中在腫瘤組織或糞便樣本中直接檢測這些細菌。我們的發現與Dejea等人的標志性研究一致，該研究描述了CRC患者的組織種生物膜的存在由pks+E.coli和ETBF組成。在我們的研究中，關于疾病的遺傳信息難以獲得。然而，關于散發性大腸癌患者的研究已經證明了結腸組織中生物膜的存在，特別是在發生于近端結腸的腫瘤中。總的來說，我們研究中49%的腸癌病例對E.coli和ETBF呈IgA陽性，69%的病例對檢測中所包括的七種E.coli蛋白中的任何一種都呈IgG陽性。雖然我們無法比較本研究與前人研究中對E.coli和ETBF的血清抗體應答率進行比較，但有幾項研究直接在組織中檢測到了這兩種細菌。有在腫瘤組織中檢測出pks+E.coli的研究指出，在大腸癌病例中檢測出pks+E.coli的病例患病率較低，為22%至55%。然而，我們的血清學檢測包括的蛋白不一定是pks+ E.coli菌株所特有的，但通常也與宿主細胞的附著、聚集和生物膜的形成有關。這運蛋白包括AIDA-I、Ag43、TIBA、I型菌毛FimA和FimH蛋白以及CsgA蛋白，CsgA蛋白是生物膜基質的主要蛋白質成分curli的一種成分。這些蛋白在不同腸癌病例中的血清抗體應答率各不相同，FIMA最低(IgA1%和IgG8%)，Ag43最高(IgA 23%和IgG 33%)。這種差異也可以由同一細胞器的不同蛋白質中引起，比如FimA和FimH作為I型菌毛的一部分，但其應答率也不同。這可能是由于重組表達的蛋白的免疫原性不同或這些蛋白被宿主免疫系統識別的程度不同所致。在我們的研究中，Ag43的IgA血清陽性是唯一與發生CRC的幾率顯著相關的抗原，這可能表明這種自身轉運蛋白在CRC發生中的重要性。有研究指出在兩個研究隊列中5%的腸癌病例中，pks+E.coli可以作為腫瘤突變的特征。這種匹配的頻率與蛋白ClbM(IgA：1%，IgG：5%)的血清抗體應答率一致，ClbM是一種從pks+島表達的MATE家族外排轉運蛋白，與E.coli毒素蛋白colibactin的易位有關。關于大腸癌組織中ETBF與患病率關系的研究報告的指出，檢測到ETBF的病例的發病率從26%到68%不等。同樣，一項分析糞便樣本的研究發現，32%的大腸癌患者ETBF DNA檢測呈陽性。雖然我們納入了BFT-1和BFT-2兩種異構體，以潛在地提高血清學檢測的靈敏度，但觀察到總體BFT應答率較低(IgA：6%，IgG：14%)。同樣，在我們研究的大腸癌病例中，E.coli和ETBF的雙重血清陽性率(IgA：5%，IgG：12%)低于Dejea等人的報道。我們必須考慮血清學是感染發生的間接或系統性手段。我們試圖分別檢測粘膜和系統的抗體反應，分別檢測IgA和IgG，然而這些不一定需要來自于結直腸的感染。此外，由于我們沒有血清學金標準來驗證我們新開發的檢測方法，我們重組表達的蛋白可能缺乏免疫原性。這在一定程度上解釋了我們研究中獲得的細菌血清流行率與之前報道的直接檢測大腸癌患者腫瘤組織或糞便樣本中的細菌種類的不同。Messaritakis等人最近的一項研究中通過檢測健康捐獻者和大腸癌患者的血液中直接檢測細菌DNA來評估腸道上皮屏障的細菌移位。但作者沒有進一步確定感染E.coli或ETBF的菌株，但在16%的健康獻血員和26%的病例中發現了大腸桿菌DNA，而脆弱芽孢桿菌DNA的檢出率分別為0%和55%。將這些數據與我們的血清學分析進行直接比較，將有助于更好地理解這項研究的結果。

在我們的研究中，IgA和IgG陽性與結直腸癌相關的OR值是相似的，盡管對于E.coli和ETBF雙重陽性檢測只對IgG的測定有統計學意義。這一觀察結果可能僅僅是由于IgG抗體的血清流行率較高，或者是雙重陽性的受試者的低流行率所致。總體而言，對所有包含的蛋白的定量IgA抗體應答均低于相應的IgG抗體應答。然而，我們也不知道與腫瘤發生相關的感染時間，以及對這兩種細菌的抗體反應時長。然而，目前尚不清楚這些微生物在癌變之前可能在多大程度上感染健康的結腸組織，或者它們是否只感染正在發育的腫瘤，這是因為細菌易位只穿過受損的腸道屏障。在這兩種情況下，細菌都可能誘導IgA類的粘膜抗體反應或IgG類的系統抗體反應，并可能產生致癌作用。由于在我們的研究中，我們既沒有能力估計血清轉換的時間點，也缺乏抽血時是否存在癌前病變的信息，所以我們的數據沒有提供這些問題的答案。文獻中的一個說明性例子描述了細菌駕駛員-乘客模型。在這方面，觀察到的溶血性鏈球菌與結直腸癌發生的關聯被認為是由于腫瘤形成導致結腸上皮屏障受損后引起局部和全身感染的“客菌”效應所致。E.coli和ETBF在結腸組織中的感染和生物膜形成的機制、由此產生的宿主免疫反應以及這兩種細菌的潛在致癌特性可能是大腸癌發生的早期事件。然而，這一假說值得進一步研究，以更好地理解大腸癌發病過程中致病序列的潛在含義。

我們的研究有幾個明顯的局限性和優勢。首先，多重血清學檢測的蛋白質選擇不是一種絕對正確的方法，而是集中在以前發表的關于潛在相關蛋白質功能的文獻上。因此，在我們的研究之前，人們對這些蛋白的免疫原性知之甚少。據我們所知，目前還沒有血清學金標準檢測方法可供驗證，我們使用這種新方法的結果需要在獨立研究中得到證實。與腫瘤組織化驗相比，使用血清學分析的一個主要優點是，大多數隊列存儲了他們研究參與者的血液樣本，從而可以對與癌癥風險的關聯進行前瞻性分析。此外，所應用的多重血清學允許對多個抗原以及不同Ig類的大量樣本進行高通量分析。這使我們能夠直接比較宿主對多個細菌物種的抗體反應，并評估了更詳細的對細菌的免疫反應，而不僅僅是總的血清陽性率。然而，由于對眾多抗原和免疫球蛋白類別進行了評估，人們也可能會認為我們的研究結果需要對多重比較進行修正。我們承認，多重檢測的比較修正可能使我們的結果失去意義。因此，需要有更大規模的研究來證實我們的發現。一般來說，多重血清學的另一個優勢是能夠量化抗體反應的水平。由于某些抗原的免疫反應低于技術極限，我們僅在血清陽性者中比較了定量抗體水平，沒有發現任何抗體水平在病例和對照之間有統計學差異的抗原。取而代之的是，我們將重點放在血清陽性上，將其作為大腸癌相關性的更有力的衡量標準。另一個限制是，我們沒有必要的數據來評估E.coli和ETBF血清陽性與腫瘤分子分型的關系(例如MSI或APC和KRAS突變狀態)。最后，盡管對相關協變量進行了控制，但不能完全排除殘留混雜。然而，這項研究設計的一個主要優點是，它基于覆蓋西歐大部分地區的大型多中心隊列，包括了詳細的前瞻性數據收集和診斷前幾年采集的血清樣本。

總之，這項嵌套在EPIC內的病例對照研究，E.coli蛋白和ETBF毒素的抗體反應與發生大腸癌的幾率較高相關，且其主要發生在腫瘤近端。這項新開發的E.coli和ETBF多重血清學試驗的首次應用需要在其他環境中進行驗證，以評估這兩種細菌的存在是否會增加發生結直腸癌的風險。