編譯：微科盟索亞，編輯：微科盟索亞、江舜堯。

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導讀   2022年2月21日，香港中文大學于君教授團隊等人在Microbiome發表題為《Altered gut metabolites and microbiota interactions are implicated in colorectal carcinogenesis and can be non-invasive diagnostic biomarkers》的文章。研究背景：腸道微生物群通過微生物及其代謝產物參與結直腸癌（CRC）的發病。微生物相關代謝產物在結直腸癌發生中的重要性表明，沿著腺瘤到癌過程研究腸道代謝組的變化，以確定其在結直腸癌發病機制中的作用具有重要意義。迄今為止，如何以及哪些微生物和代謝產物相互作用促進早期CRC發生尚不清楚。本研究的目標是確定腸道微生物相關代謝產物及其與結直腸癌發生的聯系。結果：我們對386例受試者的糞便樣本進行代謝組學和宏基因組學分析，其中包括118例CRC患者，140例結直腸腺瘤（CRA）患者和128例正常對照（NC）者。通過偏最小二乘判別分析和主成分分析，我們發現 NC 組、 CRA 組和 CRC 組之間腸道代謝產物存在差異。在改變的代謝產物中，正纈氨酸和肉豆蔻酸呈現從NC組到CRA組再到CRC組上升趨勢。與CRC相關的代謝產物富集于支鏈氨基酸、芳香族氨基酸以及氨酰-tRNA生物合成途徑。此外，代謝產物標志物（20種代謝產物）將可以鑒別NC組與CRC組，曲線下面積（AUC）為0.80，以及CRC組與CRA組，AUC為0.79。代謝組學和宏基因組學的綜合分析表明，CRC相關代謝產物和細菌之間的相關性在CRC階段發生了改變；一些關聯強度表現出增強或減弱，而有些相關性則由負相關向正相關轉變，反之亦然。腸道細菌與代謝產物標志物的組合提高了它們的診斷能力，區分CRC組與NC組，AUC：0.94；CRC組與CRA組，AUC：0.92；CRA組與NC組，AUC：0.86，表明了早期診斷結直腸腫瘤的潛力。結論：本研究強調了結直腸腫瘤發生階段潛在的早期驅動代謝產物。綜合代謝產物和微生物組分析表明，腸道代謝產物及其與腸道微生物的相互作用在結直腸癌發生過程中會受到干擾。除細菌外，糞便代謝產物還可用于結直腸腫瘤的非侵入性診斷。

   關鍵詞：糞便代謝物、腸道菌群、結直腸腺瘤、生物標志物  

論文ID 

原名：Altered gut metabolites and microbiota interactions are implicated in colorectal carcinogenesis and can be non-invasive diagnostic biomarkers

譯名：腸道代謝產物和微生物相互作用的改變與結直腸癌的發生有關，并且可以成為非侵入性診斷的生物標志物

期刊：Microbiome

IF：14.65

發表時間：2022.02.21

通訊作者：于君

通訊作者單位：香港中文大學

DOI號：10.1186/s40168-021-01208-5

實驗設計

本研究共納入386名受試者，在接受標準結腸鏡檢查后，386名受試者被分為118例結直腸癌（CRC）患者，140例結直腸腺瘤（CRA）患者和128例正常對照（NC）者。記錄所有受試者的臨床特征指標，采集糞便樣本；有CRA和CRC受試者在收集糞便樣本時均有完整的結直腸病變。對糞便樣本進行宏基因組測序分析以及代謝組分析。對宏基因組測序數據和代謝組數據進行綜合分析，鑒定區分不同組的生物標志物及其鑒定性能。

結果

1 在結直腸癌（CRC）不同階段腸道代謝產物的改變

我們的研究包括386名受試者，即118名結直腸癌（CRC）患者，140名結直腸腺瘤（CRA）患者和128名正常對照（NC）者。使用GC-TOFMS從受試者糞便樣本中共檢測出97種代謝產物。PLS-DA（圖1A）和PCA（圖 1B）圖顯示CRC組、CRA組和NC組之間的腸道代謝產物存在差異（PERMANOVA，p = 0.001），表明了在結直腸癌發生中的腸道代謝產物的改變。為了確定在CRC發展的各個階段顯著改變的重要代謝產物，我們在不同組之間進行了成對的比較。與CRC組相比，NC組的17種代謝產物發生了顯著的改變；其中L-丙氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-絲氨酸、肉豆蔻酸、苯乳酸、氧代戊二酸、L-苯丙氨酸、L-α-氨基丁酸、苯乙酸、棕櫚油酸、3-氨基異丁酸和正纈氨酸在NC組富集。相比之下，與NC組相比，CRC組患者的丁酸含量降低（圖1C和圖S3A，表S2）。與CRC組相比，CRA組患者36種代謝產物差異顯著，其中5-十二碳烯酸、亞油酸、α-亞麻酸和丁酸的含量降低（圖1D和圖S3B，表S3）。有趣的是，與NC組和CRA組受試者相比，L-丙氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-絲氨酸、肉豆蔻酸和苯基乳酸在CRC組中富集（圖1C和D，圖S3）。此外，我們還發現正纈氨酸和肉豆蔻酸顯示出從NC組到CRA組再到CRC組的增加趨勢（圖S4），這表明它們對結腸腫瘤發生有潛在的幫助。為了深入了解每兩組之間顯著改變代謝產物的功能，我們進行了代謝集富集分析（Metabolite Set Enrichment Analysis，MSEA）。我們觀察到與支鏈氨基酸（BCAA）代謝相關的通路在導致CRC的各個階段存在差異。與NC組（圖1E）和CRA組（圖1F）相比，CRC組中前4個富集的代謝途徑是（1）氨酰-tRNA生物合成；（2）纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成；（3）苯丙氨酸代謝和（4）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，這表明在結直腸癌發生過程中，除了個體代謝產物外，代謝途徑也發生了改變。

圖1. 代謝組學數據概況及代謝通路富集分析。 （A）CRC組、CRA組和NC組的主成分分析（PCA）；（B）CRC組、CRA組和NC組的偏最小二乘判別分析（PLS-DA）；（C）CRC組和NC組之間17種顯著改變的代謝物標準值熱圖；（D）CRC組和CRA組之間36種顯著改變的代謝物標準值熱圖；使用來自成對PLD-D分析和 Wilcoxon秩和檢驗的VIP值確定顯著改變的代謝物，其中VIP > 1和p < 0.05；（E）CRC組和NC組之間17種差異代謝物的代謝途徑富集分析；（F）CRC組和CRA組之間36種差異代謝物的代謝途徑富集分析；CRC，結直腸癌；CRA，結直腸腺瘤；NC，健康對照。 

2 作為結直腸癌（CRC）診斷標志物的代謝產物

我們進一步研究了腸道微生物相關代謝產物在CRC的非侵入性診斷中的潛在應用價值。使用已鑒定的顯著改變代謝產物（圖1C和D），我們建立逐步邏輯回歸模型來鑒別不同的受試組。我們的模型選擇了20種代謝產物作為標志物，可以將NC組受試者與CRC組受試者區分開來，曲線下面積（AUC）為0.80（圖2A）。相同的20個標志物可以將CRC組與CRA組區分開來，AUC為0.7889（圖2B），CRA組與NC組的AUC為0.661（圖2C）。為了區分CRA組與NC組，我們鑒定了11種代謝產物標志物，AUC為0.6853（圖2D）。這11種代謝產物標志物可以區分CRA組與CRC組以及CRC組與NC組，AUC分別為0.7464和0.6764（圖2E和F）。CRC組可以通過13種代謝產物標志物與CRA組區分開來，AUC為0.81（圖2G）。使用這13種代謝產物標志物，區分CRC組與NC組以及CRA組與NC組，AUC分別為0.7168和0.6648（圖2H和I）。同時，我們還通過10倍交叉驗證的隨機森林對識別標記的可靠性進行了驗證（圖S6）。此外，調整臨床特征，即年齡、性別和肥胖，改善了所有代謝標志物的可靠性，AUCs約增加了8%（圖S5）。

圖2. 用于區分成對的CRC組、CRA組和NC組的代謝標志物。（A）用于區分CRC組和NC組的20種代謝物標記的接受者操作特征（ROC）分析；（B）用區分CRC組與NC組的20個代謝物標志物來區分CRA組和NC組的ROC分析；（C）用區分CRC組與NC組的20個代謝物標志物來區分CRC組和CRA組的ROC分析；（D）用于區分CRA組和NC組的11種代謝物標志物ROC分析；（E）用區分CRA組和NC組的11個代謝物標志物來區分CRC組和NC組的ROC分析；（F）用區分CRA組和NC組的11個代謝物標志物來區分CRC組和CRA組的ROC分析；（G）用于區分CRA組和CRC組的13種代謝物標志物ROC分析；（H）用區分CRA組和CRC組的13個代謝物標志物來區分CRC組和NC組的ROC分析；（I）用區分CRA組和CRC組的13個代謝物標志物來區分CRA組和NC組的ROC分析；CRC，結直腸癌；CRA，結直腸腺瘤；NC，健康對照。

3  作為結直腸癌（CRC）診斷標志物細菌物種

腸道菌群失調與結腸腫瘤發生有關。我們使用所有受試者的糞便鳥槍宏基因組學序列數據，進一步研究了細菌在CRC發展的各個階段顯著改變的細菌。通過NMDS β多樣性分析，表明了CRC組、CRA組和NC組之間的細菌群落存在差異（p = 0.001；圖3A）。與NC組（圖3B）和CRA組（圖3C）的受試者相比，Peptostreptococcus stomatis、Fusobacterium nucleatum、Parvimonas micra、Peptostreptococcus anaerobius和Bacteroides fragilis再CRC組中顯著富集；而與NC組（圖3B）和CRA組（圖3C）的受試者相比，Coprobacter fastidosus、Eubacterium ventriosum、Roseburia interinalis和Roseburia inulivorans再CRC組患者中顯著減少。Leptotrichia buccalis和Prevotella veroralis會沿著NC組到CRA組再到CRC組呈現增加的趨勢（圖S7A），而Lachnospiraceae bacterium1_4_56FAA和Eubacterium dolichum則會沿著NC組到CRA組再到CRC組呈現減少的趨勢（圖S7B）。此外，我們使用逐步邏輯回歸模型來識別具有潛在的診斷價值細菌物種。結果發現，F. nucleatum、P. anaerobius、P. micra、R. inulinivorans、E. corrodens和X. perforans可以將CRC組與NC組區分開來，AUC為0.905，與我們之前的研究結果相一致（圖3D）。這6種細菌標志物將可以CRC組與CRA組區分開來，AUC為0.8877（圖S8A），而區CRA組與NC組的AUC為0.602（圖S8B）。CRA組與NC組可以被14種細菌物種區分開來，AUC為0.8408（圖3E）。這14種細菌標志物還可以區分NC組與CRC組，AUC為0.8207（圖S8C）和CRA組與CRC組，AUC為0.8925（圖S8D）。包括 F. nucleatum在內的6種細菌標志物可以區分CRC組與CRA組，AUC為0.9071，（圖3F）。這6種細菌標志物還可以區分CRC組與NC組以及CRA組與NC組，AUC分別為0.8545和0.7188（圖S8E和F）。我們通過10倍交叉驗證的隨機森林進一步驗證了細菌標志物。與代謝產物標志物相比，通過調整年齡、性別和肥胖，細菌標志物AUC沒有得到顯著的改善（圖S9和圖S10）。

圖3. 宏基因組數據概況和診斷性能。（A）CRC組、CRA組和NC組細菌物種豐度基于Bray-Curtis距離的非度量多維標度（NMDS）分析；（B）CRC組和NC組之間44種豐富度差異的細菌物種熱圖；（C）CRC組和CRA組之間44種豐富度差異的細菌物種熱圖；使用Wilcoxon秩和檢驗確定相對豐富度差異的物種；FDR調整后的p < 0.05，相對豐度的平均值 > 0.001和流行率 > 0.4；（D）用于區分CRC組和NC組的6種細菌物種的接受者操作特征（ROC）分析；（E）用于區分CRA組和NC組的14種細菌物種的ROC分析；CRC，結直腸癌；CRA，結直腸腺瘤；NC，健康對照。

4  細菌標志物提高了代謝產物標志物的診斷能力

為了探究是否可以更好地區分結直腸癌不同的發生階段，我們通過逐步邏輯回歸模型，將代謝產物標志物和細菌標志物結合起來。11種代謝產物標志物（2-羥基丁酸、γ-氨基丁酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、正纈氨酸、鳥氨酸、氧代己二酸、氧代戊二酸、棕櫚油酸、苯乙酸和庚二酸）和6細菌物種（F.  nucleatum、P.  anaerobius、P. micra、R. inulinivorans、E. corrodens和X. perforin）可以區分NC組與CRC組，AUC達到了更高的0.9417（圖4A），而僅使用代謝產物標記的AUC為0.905。代謝產物標志物和細菌標志物的組合還可以將CRA組與NC組以及CRC組與CRA組區分開來，AUC分別為0.6728和0.92（圖S11A和B）。L-天冬酰胺和苯乳酸與14種區分CRA組與NC組細菌標志物的結合可以將AUC從0.8408提高到0.8759（圖4B）。這樣代謝產物與細菌的組合可以區分NC組與CRC組，AUC為0.8195（圖S11C）以及CRA組與CRC組，AUC為0.8976（圖S11D）。此外，α-亞麻酸、L-高絲氨酸、苯乙酸和苯乳酸與6種區分CRC組與CRA組的細菌標志物的結合可以將AUC從0.9071提高到0.9375（圖4C）。用于區分CRC組與CRA組的10種代謝產物和細菌標志物的組合也可以將CRC組與NC組以及CRA組與NC組分類，AUC分別為0.8723和0.7499（圖 S11E 和 S11F），這證實了代謝產物與細菌相結合早期診斷CRA的潛力。

圖4. 用于區分成對的CRC組、CRA組和NC組的細菌和代謝物標志物的組合。 （A）用于區分CRC組和NC組的6種細菌物種和11種代謝物組合的接受者操作特征（ROC）分析；（B）用于區分CRA組和NC組的14種細菌物種和2種代謝物組合的ROC分析；（C）用于區分CRA組和CRC組的6種細菌物種和4種代謝物組合的ROC分析；CRC，結直腸癌；CRA，結直腸腺瘤；NC，健康對照。  

5 在結直腸癌（CRC）中，代謝產物和細菌之間的相互作用發生了改變

為了探究顯著改變的代謝產物和豐富度顯著差異的細菌物種之間潛在的相互作用，我們使用零膨脹負二項（Zero-inflated Negative Binomial，ZINB）回歸進行了關聯分析。在CRC階段的相互作用分布顯著不同（圖S12）。此外，一些相互作用隨著CRC進展呈增加或減少趨勢，而一些相互作用則從負相關轉變為正相關（圖S13A），反之亦然（圖S13B）。在鑒別CRC組與NCZ組的6種細菌物種中，P.  anaerobius與甘氨酸之間的相關性顯著，且隨著CRC的發展而增加（p < 0.05，表 S4），而P. anaerobius與肉豆蔻酸之間的相關性顯著，但會隨著CRC的發展而降低。P. micra與亞油酸和L-纈氨酸顯著相關，并且相關性聯都遵循從NC組、到CRA組，再到CRC組的下降趨勢。在區分CRA組和NC組的14種細菌標志物中，Clostridium symbiosum與在CRC組富集的L-纈氨酸和L-高絲氨酸顯著相關，并且相關性的強度隨著CRC的發展而增加。此外，Synergistes sp.3_1_syn1與L-天冬氨酸和L-酪氨酸顯著相關，并且相關性會隨著CRC的發展均呈下降趨勢。Porphyromonas gingivalis與γ-氨基丁酸之間以及Prevotella nigrescens與L-天冬酰胺之間的也存在顯著的相關性，并且隨著CRC的發展而降低（表S4）。我們進一步研究了與CRC相關的代謝產物之間的相互作用。在CRC組減少的代謝產物丁酸與在CRC組富集的代謝產物（包括庚二酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸和L-異亮氨酸）顯示出獨有的相互作用。此外，CRC組富集的代謝產物之間存在很強的共現關系，例如L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-蛋氨酸、氧代戊二酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、γ-氨基丁酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸和 L-酪氨酸，這證明了它們在CRC發生過程中的潛在作用（圖S14）。綜上所述，這些結果表明腸道代謝產物和細菌之間存在顯著的相關性，這些相關性會隨著結直腸癌發生的階段而發生變化。

討論

越來越多的研究結果表明，腸道微生物及其代謝產物在結直腸腫瘤發生中發揮了重要作用。在本研究中，我們分析了CRC患者的糞便代謝產物和微生物組，并將其與癌癥前期的CRA患者和健康受試者的糞便代謝產物和微生物組進行了比較分析。我們的結果證明了關鍵的代謝途徑在CRC發病過程中被破壞。綜合代謝組和微生物組分析表明，CRC相關細菌和代謝產物之間的相互作用隨著CRC的發展而改變。重要的是，我們證明了除了細菌外，糞便代謝產物在非侵入性診斷CRC的潛力。

代謝組學具有診斷癌癥（包括CRC）的潛力。我們的代謝組學分析表明，與CRA組和NC組受試者相比，L-丙氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-絲氨酸、肉豆蔻酸和苯乳酸在CRC患者中富集。氨基酸在分子生物合成的步驟中發揮著重要作用，它們維持著氧化還原平衡，并作為能量來源。豐富的氨基酸也被認為是促進癌細胞增殖的關鍵因素。氨基酸衍生物可以影響免疫反應和調節表觀遺傳學。因此，據報道它們與致癌作用有關。在本研究中，被確定為與CRC相關的丙氨酸已被證明是一些胃腸道癌癥的重要生存信號。例如，基質細胞分泌TCA循環所需的丙氨酸，促進胰腺癌的生長。此外，甘氨酸可以為核酸、脂質和蛋白質的合成提供必要的前體，從而支持癌細胞的生長。有研究表明，脯氨酸生物合成上調并與癌癥預后不良有關，這支持了我們在本研究中的結果。有趣的是，發現正纈氨酸和肉豆蔻酸從NC組到CRA組再到CRC組呈增加趨勢。正纈氨酸是纈氨酸的異構體，它與巨噬細胞對乳腺腫瘤細胞的細胞毒活性有關。還有研究表明，正纈氨酸還可以通過抑制核糖體蛋白S6激酶beta-1部分促進組織再生和肌肉生長。肉豆蔻酸是一種常見的不飽和脂肪酸，與人類的高膽固醇水平呈正相關，據報道會增加患乳腺癌的風險。這兩種代謝產物在結直腸癌發展過程中的增加趨勢表明了它們在結直腸腫瘤發生中的潛在作用，值得進一步研究。在本研究中，CRC組患者中唯一減少的代謝產物是丁酸，丁酸是一種由膳食纖維在大腸中發酵產生的短鏈脂肪酸。研究已經證明，丁酸通過抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡對結直腸癌具有保護作用，進一步支持了我們在本研究中的發現。 代謝通路富集分析表明，與健康受試者相比，CRC組患者和腺瘤患者的氨酰-tRNA生物合成、芳香族氨基酸生物合成和BCAAs代謝發生了顯著改變。氨酰-tRNA生物合成需要氨酰-tRNA合成酶，這是一類重要的酶，具有進化上保守的蛋白質合成機制，其中一些與結直腸腫瘤的發展呈正相關。在本研究中，與CRA組和健康受試者相比，包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸在內的BCAA在CRC組中上調。這些BCAAs是癌癥發展的必需營養素，被腫瘤細胞用于各種生物合成途徑和作為能量來源。此外，我們還觀察到腸道微生物在包括酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在內的芳香族氨基酸的代謝中發揮著積極的作用。有研究表明，調節血清芳香族氨基酸水平會破壞無菌小鼠的腸道通透性和全身免疫。這表明本研究中觀察到的芳香族氨基酸生物合成失調可能通過受損的腸道屏障誘導CRC的發生。此外，有研究表明，色氨酸代謝途徑與通過宿主-腸道微生物界面治療胃腸道疾病有關。在本研究中發現在CRC組患者中上調的苯丙氨酸是一種必需氨基酸，可能有助于癌細胞的增殖和遷移。我們的結果得到了前人研究結果的支持，表明BCAAs、芳香族氨基酸和苯丙氨酸代謝組學途徑可能在結直腸癌發生中起重要作用。

我們進一步探討了腸道微生物相關代謝產物在CRCD非侵入性診斷中的潛在應用。為了區分CRC組與NC組和CRA組，分別鑒定了20和13個代謝產物標志物，AUC均約為0.80。6個細菌物種可以將CRC組與NC組和CRA組區分開來，AUC分別為0.91和0.89。通過代謝產物和細菌標志物的結合，11個代謝產物和6個細菌物種（F. nucleatum、P. anaerobius、P. micra、R. inulinivorans、E. corrodens和X. perforans）可以得到更好的鑒別能力（AUC=0.94）。有趣的是，我們觀察到4種代謝產物的組合（α亞油酸、 l- 高絲氨酸、苯乳酸和苯乙酸），以及細菌標志物（F. nucleatum，P. anaerobius, P. micra，R. inulinivorans，E. corrodens和X. perforans）可以區分NC組與CRA組，AUC為0.7499；這表明了在健康患者中早期診斷結直腸腺瘤的潛力。此外，我們的相關性分析表明，與NC組和CRA組受試者相比，CRC組患者的代謝產物和細菌之間的相關性存在顯著差異。有些相關性會隨著CRC發展呈現增加或減少的趨勢，還有些相關性從正相關轉為負相關，反之亦然。值得注意的是，幫助癌細胞生長的甘氨酸與通過PI3K-Akt-NF-κB信號通路驅動CRC發展的P. anaerobius之間的相關性增加，這表明甘氨酸和P. anaerobius在CRC的發展中有潛在的合作。此外，我們發現豐富度從健康受試者到腺瘤患者，再到結直腸癌患者增加的Clostridium symbiosum與CRC組富集的L-纈氨酸和L-高絲氨酸顯著相關，并且相關性會隨著CRC的發展而增加。總的來說，我們的結果表明腸道代謝產物和細菌之間存在顯著的相互作用，這可能會影響結直腸癌的發生。

在本研究中的微生物相關代謝產物是基于代謝組學數據和人類腸道微生物相關代謝產物的化學性質。氯    甲酸烷基酯衍生方法用于GC-TOF/MS檢測。由于膽汁酸的強極性，GC-MS響應較差。最近開發了用于特異性檢測膽汁酸的新方法，其與CRC發生的關聯將在未來的研究中進行。總之，我們的綜合代謝組和微生物組研究表明，腸道代謝產物和微生物組在結直腸癌發生的各個階段會發生變化，代謝產物和細菌物種的結合可以增加非侵入性診斷結直腸癌和腺瘤的能力。本研究表明了CRC腫瘤發生過程中潛在的早期驅動代謝產物，并為進一步的實驗提供了信息，以便開發更好的CRC診斷和預防策略。