a. 所有標本應及時固定（離體30分鐘內固定最佳），使用新鮮的3.7％中性緩沖甲醛固定液，固定液的量應為組織的10倍，固定時間8-48小時。

b. 標本應由內鏡或手術醫師充分展開，黏膜面向上，在標本邊緣用大頭針固定于軟木板或泡沫板上釘板固定。應每隔2-3mm垂直于黏膜面切開全部取材。

c. “腺瘤伴浸潤性癌”是指腺瘤含有穿透黏膜肌層浸潤到黏膜下層的腺癌（pT1）。“腺瘤伴高級別上皮內瘤變”包括了腺瘤伴重度異型增生、原位癌和黏膜內癌。“高級別腺癌”、“腫瘤距離切緣小于1mm”、“脈管侵犯”和“高級別腫瘤出芽”為預后不良因素。

d. 根治術標本，通常沿腫瘤對側剪開腸管后固定，建議釘板固定。

e. 全直腸系膜切除術（total mesorectal excision, TME）的直腸癌標本，系膜完整性評估標準見附表1。

f. “環周切緣”是指沒有腹膜覆蓋的腸壁“基底”切緣，建議手術醫師在環周切緣處涂色或加以標識。“環周切緣陽性”是指腫瘤距離切緣小于或等于1mm。 

g. 淋巴結按淋巴引流方向進行取材并分組（腸旁、中間、中央），未經新輔助治療的根治術標本，檢出淋巴結總數原則上不少于12枚。若第一次未找到12枚淋巴結，建議復檢。

h. 結直腸癌組織學分型參考WHO消化系統腫瘤分類2019版，見附表2。

i. 組織學分級包括傳統的4級分法和WHO分類的2級分法，基于腺體形成的程度，見附表3。

j. TNM病理分期（pTNM）采用AJCC/UICC第8版，pTNM前加前綴m、r和y分別代表多發性原發腫瘤、復發性腫瘤和治療后腫瘤的TNM病理分期。

k. 腫瘤退縮分級（TRG）的病理學評估依據殘留腫瘤成分以及纖維化程度進行分析。推薦使用AJCC第8版TRG評分系統，見附表4。

l. 根據鑒別目標選取，結直腸腺癌典型的免疫表型為CK7-/CK20+/CDX2+。

m. 錯配修復（MMR）蛋白的檢測：免疫組織化學方法檢測4個常見MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）的表達，陽性表達定位于細胞核。任何1個蛋白表達缺失為dMMR（錯配修復功能缺陷），所有4個蛋白表達均陽性為pMMR（錯配修復功能完整）。

n. 微衛星不穩定（MSI）：建議采用美國國家癌癥研究院（NCI）推薦的5個微衛星（MS）檢測位點（BAT25、BAT26、D5S346、D2S123和D17S250）。判斷標準為三級：所有5個位點均穩定為MSS（微衛星穩定），1個位點不穩定為MSI-L（微衛星低度不穩定），2個及2個以上位點不穩定為MSI-H（微衛星高度不穩定）。MSI多由MMR基因突變及功能缺失導致，也可以通過檢測MMR蛋白缺失來反映MSI狀態。一般而言，dMMR相當于MSI-H， pMMR相當于MSI-L或MSS。dMMR/MSI-H的結直腸癌治療具有特殊性。

o. RAS和BRAF基因突變檢測：檢測位點包括KRAS和NRAS基因的第2、3、4號外顯子及BRAF基因的V600E。結直腸癌原發灶與轉移灶的RAS和BRAF基因狀態一致性較好，基于樣本的可獲取性，原發灶及轉移灶均可進行檢測。當原發灶和轉移灶對治療反應不一致時，建議對原發灶和轉移灶都進行檢測。除在轉移性結直腸癌中具有療效預測作用以外，RAS和BRAF基因狀態對結直腸癌患者也具有預后指導意義。

p. 基因突變檢測可采用DNA直接測序法或ARMS法。通量更高、速度更快的高通量測序技術（high-throughput sequencing）或稱二代測序技術（next-generation sequencing technology, NGS）也逐步運用于臨床基因檢測。使用獲得認證的NGS技術平臺和檢測產品，經過嚴格的質量控制，執行規范的操作流程，才能確保檢測結果的準確性。建議在檢測報告中明確基因狀態（如野生、突變或可疑）。使用NGS等定量檢測方法檢測RAS和BRAF基因突變時，建議以5％作為突變豐度的截斷值。

q. 腫瘤出芽是指在浸潤性癌的浸潤側前沿，間質內散在的單個腫瘤細胞或≤4個腫瘤細胞的細胞簇。研究表明，腫瘤出芽是Ⅱ期結直腸癌預后相關指標。在pT1結直腸癌（包括惡性息肉）中，高級別腫瘤出芽與淋巴結轉移風險增高有關。2017年在Modern Pathology發表的“基于腫瘤出芽國際共識（ITBCC）2016 ”得到較為廣泛的認同，可參照該共識對結直腸癌腫瘤出芽進行分級和報告。腫瘤出芽分級為三級分法，具體方法為：在20倍目鏡（0.785mm）下選定一個熱點區域進行瘤芽計數，0-4個為低級別，5-9個為中級別，≥10個為高級別。

r. 抗HER2治療和NTRK抑制劑的使用在結直腸癌治療中得到越來越多的重視。在有條件的情況下，對標準治療后失敗的結直腸癌患者可以進行HER2狀態和NTRK基因融合的檢測。HER2狀態的檢測方法類似于乳腺癌和胃癌，可以采用免疫組織化學和熒光原位雜交（FISH）的方法。目前結直腸癌HER2陽性的判斷標準僅來自于臨床研究，尚未建立經過權威機構認證的伴隨診斷的判讀標準。在一項已發表的、結果為陽性的臨床研究中，免疫組織化學檢測HER2陽性定義為：大于50％的腫瘤細胞呈現3+陽性（即細胞膜的基底、側邊或側邊或整個胞膜呈強陽性著色）；HER2評分為2+的患者應通過FISH檢測進一步明確HER2狀態，HER2基因擴增的陽性定義為大于50％的腫瘤細胞HER2/CEP17比值≥2.0。NTRK基因融合在結直腸癌中非常罕見，發生率約為0.35％，僅限于RAS和BRAF野生型的結直腸癌，且絕大多數為dMMR/ MSI-H的結直腸癌。檢測NTRK基因融合的方法有多種，免疫組織化學染色是一種快速、經濟的初篩方法，但對NTRK基因融合仍需使用FISH或NGS方法進行驗證。使用獲得認證的技術平臺和檢測產品，經過嚴格的質量控制，執行規范的操作流程，才能確保檢測結果的準確性。