結直腸癌中KＲAS、NＲAS 基因突變與臨床病理特征的關系

文章發表于：《中國老年學雜志》

作者：潘理會、李育莊、李春輝（承德醫學院）

本文由網友“心未老”推薦（請勿轉載）

【摘要】

目的：探討結直腸癌( CＲC) 中大鼠肉瘤病毒癌基因( KＲAS) 、大鼠肉瘤病毒轉化基因( NＲAS) 基因的常見突變類型與臨床病理參數的關系。

方法：從CＲC 石蠟包埋組織中提取基因組DNA，采取實時熒光定量PCＲ 法進行KＲAS、NＲAS 基因擴增，分析其突變狀態與CＲC 臨床病理參數的關系。

結果：檢測到86 例( 36. 1%) KＲAS 基因突變，總突變率為11例( 4. 6%) NＲAS 基因突變。不同淋巴結轉移及Duke 分期的組間KＲAS 突變差異有統計學意義( P＜0. 05) ，而在不同年齡、性別，腫瘤發生部位、組織學分型、分化程度、浸潤深度的組間差異無統計學意義( P＞0. 05) ； NＲAS 突變在不同年齡、性別、腫瘤發生部位、組織學類型、分化程度、淋巴結轉移、Duke 分期及浸潤深度的組間差異均無統計學意義( P＞0. 05) ； KＲAS 與NＲAS二者之間突變無相關性。

結論：CＲC 中KＲAS 突變較高，NＲAS 突變相對較低； KＲAS 突變與CＲC 的侵襲、轉移有關，二者在CＲC 的進程中可能是獨立發揮著促進作用。

【關鍵詞】結直腸癌； KＲAS 基因； NＲAS 基因； 突變；

研究報道結直腸癌( CＲC) 的發生、發展與表皮生長因子受體( EGFＲ) 介導的信號傳導通路EGFＲ/大鼠肉瘤( ＲAS) /鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1( BＲAF) 的調控密切相關[1]，近年一些靶向EGFＲ的單抗藥物已成功應用于CＲC 的臨床治療，取得良好療效，但抗EGFＲ 單抗藥物的有效性受其下游ＲAS 基因[包括大鼠肉瘤病毒癌基因( KＲAS) 、大鼠肉瘤病毒轉化基因( NＲAS) ]類型的影響，對ＲAS 野生型攜帶者療效顯著，對ＲAS 突變型患者療效不佳。目前檢測KＲAS 和NＲAS 基因突變狀態已成為眾多專家學者研究腫瘤靶基因治療的熱點課題，本文采用實時熒光定量PCＲ 檢測KＲAS、NＲAS 基因在CＲC 組織中的表達情況，并結合臨床病理參數探討二者在CＲC 發生、發展中的作用機制。

1 資料與方法

1. 1 研究對象

選取2012 年12 月至2015 年5 月間承德醫學院附屬醫院行手術切除的CＲC 蠟塊標本238 例。所選標本均有完整的臨床病歷及病理資料，且術前均未接受任何化療及抗腫瘤藥物治療。

1. 2 DNA 提取

CＲC 石蠟包埋組織連續切片4 μm厚1 ～ 2 張，蘇木精-伊紅( HE) 染色，顯鏡下觀察形態，標記腫瘤細胞比例達70%以上的標本。將做好標記的標本連續切片8 ～ 10 μm 厚5 ～ 6 張，常規脫蠟、水化處理，刮取腫瘤組織于EP 管內，按照試劑盒說明書步驟提取DNA，應用紫外分光光度計測定提取DNA 的質量和濃度，A260 /A280 在1. 7 ～2. 1 之間為符合標準。

1. 3 實時熒光定量PCＲ擴增

采用PCＲTaqMan探針技術檢測標本中KＲAS、NＲAS 基因的突變情況，嚴格按照檢測試劑盒說明書進行操作。反應體系包括模板50 ng、正反向引物各25 pmol、MasterMix 及TaqMan 標記探針，總反應體系各為50 μl。反應條件分3 步: 第1 步: 42℃ 5 min，95℃ 5 min，1個循環； 第2 步: 95℃ 25 s，64℃ 20 s，72℃ 20 s，15個循環； 第3 步: 93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，31個循環，第3 階段60℃收集信號，進行實時熒光定量PCＲ。每次實驗均設定突變的陰、陽性及空白對照孔。

1. 4 結果判讀

以無模板對照擴增曲線的最高點為準設定閾值，沒出現擴增曲線或Ct≥28. 0 的標本為陰性標本； 出現擴增曲線且Ct≤26. 0 的標本為陽性標本； 26. 0 ＜Ct ＜ 28. 0 的標本為可疑陽性，重復檢測。

1. 5 試劑與儀器

石蠟組織DNA 提取試劑盒及人KＲAS、NＲAS 基因突變檢測試劑盒均購自廈門艾德生物醫藥科技有限公司； 實時熒光定量PCＲ 儀購自杭州赫貝科技有限公司。

1. 6 統計學方法

采用SPSS11. 5 軟件進行χ2 檢驗、Pearson 相關性分析。

2 結果

2. 1 KＲAS 基因突變情況及與臨床病理特征的關系

86 例( 36. 1%) KＲAS 基因突變，隨著淋巴結遠處轉移和Duke 分期的增高KＲAS 突變率明顯增加( P＜0. 05) ，在其他臨床病理特征的組間差異均無統計學意義( P＞0. 05) ，見表1。

2.2  NＲAS 基因突變情況及與臨床病理特征的關系

11 例( 4. 6%) NＲAS 基因突變。NＲAS 突變率在各臨床病理特征的組間差異均無統計學意義( P＞0. 05) ，見表2。

2. 3 CＲC 組織中KＲAS 與NＲA 基因突變的相關性

未檢測到KＲAS 與NＲAS 同時突變者，表明二者突變相互排斥，相關分析顯示，KＲAS 與NＲAS 突變沒有明顯相關性( r = 0. 782，P = 0. 058) 。

3 討論

EGFＲ 是一種酪氨酸激酶受體，與配體結合后激活刺激其介導的下游信號傳導通路膜受體酪氨酸蛋白激酶信號傳遞途徑( ＲAS /ＲAF /MAPK) 發生級聯反應，導致細胞異常增殖、轉移，發生癌變[1]�？笶GFＲ 單抗可通過拮抗其與配體的結合，阻止其活化，進而阻斷其下游信號通路的傳導，從而發揮抗瘤作用。KＲAS 與NＲAS 基因是EGFＲ 通路下游調控因子ＲAS 家族的重要成員，二者中任何一種發生突變都可不通過EGFＲ 活化刺激而直接激活EGFＲ 通路引發癌變。國外文獻報道在CＲC 中KＲAS 突變率為30%～55%，主要發生在2 外顯子12 和13 密碼子上； NＲAS 突變率為1%～ 6%，主要發生在3 外顯子61 密碼子上[2，3]。國內研究報道CＲC 中KＲAS突變率為43. 8%，NＲAS 突變率較低為1. 9%[4]。也有報道CＲC 中KＲAS 突變率為42. 57%，NＲAS 突變率為3. 96%[5]。本研究與國內外報道的基本相符，同時本研究數據顯示KＲAS 突變率明顯高于NＲAS，KＲAS 突變在CＲC 中是常見的生物學事件，可能是CＲC 發病的主要機制之一，而NＲAS 可能不是主要機制。KＲAS 的突變狀態可作為臨床選用抗EGFＲ 單抗藥物的重要參考指標，而NＲAS 突變狀態的預測價值還在探討中。研究表明，對CＲC 患者行單一檢測KＲAS 基因是不夠的，還要聯合檢測NＲAS 基因，只有聯合檢測KＲAS、NＲAS 基因的CＲC 的患者才能建議使用EGFＲ 靶向藥物治療[6]，所以，腫瘤組織中NＲAS 突變率雖然偏低，其突變狀態的檢測是不可忽視的，聯合檢測KＲAS、NＲAS 基因突變狀況，對篩選出適應抗EGFＲ 靶向藥物治療的患者有重要的指導價值。

目前，關于KＲAS 和NＲAS 突變狀態與CＲC 中臨床病理參數的關系報道無統一定論。有文獻報道，CＲC 中KＲAS 突變在有淋巴結轉移和TNM 分期增加的患者中明顯增高[7]； CＲC 中KＲAS 突變更常見于女性和近端結腸[8]； CＲC 中NＲAS 突變在遠端結直腸癌突變率較高[9]； 還有研究報道CＲC 患者KＲAS /NＲAS 突變與年齡相關，≥65 歲的老年患者突變率較高，而與性別、原發部位、組織學類型、分化程度、分期、區域淋巴結轉移、術后復發轉移均無關[10， 11]。吳新新等[12]對147 例CＲC 患者的KＲAS和NＲAS 基因突變情況進行檢測，發現KＲAS 突變的發生更傾向于淋巴結轉移及Duke 分期C 期患者，與年齡、性別、腫瘤部位、組織學類型、分化程度、遠處轉移、癌結節及美國癌癥聯合會( AJCC) 分期等均無關； NＲAS 突變與上述所有病理特征均無相關關系。代云等[13]對265 例CＲC 患者的KＲAS 和NＲAS 基因突變情況進行檢測，發現二者突變與年齡相關，高齡患者突變率較高，而與性別、原發部位、組織學類型、分化程度、TNM 分期、區域淋巴結轉移、遠處轉移、術后復發轉移等臨床病理特征均無關。本研究表明KＲAS 參與了CＲC 的侵襲、轉移，預示患者預后不良； KＲAS 突變對高危轉移患者的早期篩選和預后評估有重要參考價值，也為腫瘤的侵襲、復發機制研究提供了新的方向。上述結論各家研究，差異很大，造成這些差異的原因，可能與各家研究的樣本量、檢測方法及判讀標準不同等因素有關，有待于進一步研究探討。上述研究結果表明KＲAS 和NＲAS 雖同為一個家族成員，同為EGFＲ信號通路下游重要的效應因子，但在腫瘤發生、發展過程中所起的調控作用不盡相同。近年來，國內外對CＲC 中EGFＲ 信號通路上KＲAS /NＲAS 突變狀態與臨床病理參數關系的研究剛剛興起，許多認識還不夠成熟，尤其對NＲAS 的檢測較少且檢出率偏低，提示臨床CＲC 患者抗EGFＲ 藥物治療時，應多基因聯合檢測來指導靶向藥物方案的制定。明確KＲAS /NＲAS 與CＲC 病理參數的相關性，有助于闡明CＲC 發病機制，有助于CＲC 的靶基因治療。對二者突變狀態的檢測還應擴大檢測規模，采取多種研究手段，綜合論證分析。目前，關于腫瘤中KＲAS和NＲAS 突變之間相關性的研究國內外少見報道，有資料顯示，CＲC 中KＲAS 和NＲAS 之間基本不存在交叉突變[14]，二者突變相互排斥[15]。本研究與上述研究結果相一致，經相關分析顯示，KＲAS 和NＲAS 之間突變沒有關聯，提示二者可能是彼此獨立的影響著CＲC 的進程，具體機制還需進一步研究。

【參考文獻】

[1] Ouerhani S，Bougatef K，Soltani I， et al．The prevalence and prognostic significance of KＲAS mutation in bladder cancer，chronic myeloid leukemiaand colorectal cancer[J]． Mol Biol Ｒep，2013； 40 ( 6 ) :4109-14.

[2]Ｒiely GJ，Ladanyi M. KＲAS mutations: an old oncogene becomes a new predictive biomarker[J]．J Mol Diagn，2008； 10( 6) : 493-5.

[3]Downward J. Targeting ＲAS signalling pathways in cancer therapy [J]．Nat Ｒev Cancer， 2003； 3( 1) : 11-22.

[4]孫新超，秦旭，王金海，等. 結直腸癌患者腫瘤組織中KＲAS、NＲAS、BＲAF 基因突變狀態分析[J]． 社區醫學雜志，2017； 15( 11) : 8-11.

[5]吳永芳，徐春偉，宋業潁，等. 結直腸癌患者腫瘤組織中KＲAS、NＲAS 和BＲAF 基因突變的分子病理檢測分析[J]．臨床與病理學雜志，2015； 35( 7) : 1385-9.

[6] Dai L，Song L，Li X， et al．Association of visit-to-visit blood pressurevari ability with the risk of all-cause mortality and cardiovascular events in general population[J]． J Clin Hypertens，2018； 20 ( 2 ) :280-8.

[7]羅妙玲，徐韞健. 結直腸癌KＲAS、BＲAF 及PIK3CA 基因突變狀態分析[J]．熱帶醫學雜志， 2016； 16( 7) : 843-6.

[8]晉龍，眭玉霞，王麗萍，等. 結直腸癌KＲAS 突變與臨床病理特征的關系[J]．基礎醫學與臨床，2018； 38( 1) : 32-6.

[9]OguraT，Kakuta M，Yatsuka T， et al．Clinicopathological characteristics and prognostic impact of colorectal cancers with NＲAS mutations[J]．Oncol Ｒep， 2014； 32( 1) : 50-6.

[10]李艷艷，高靜，楊蕊，等. 結直腸癌ＲAS、BＲAF、KＲAS、PIK3CA基因突變分析與臨床病理特征的關系[J]． 臨床腫瘤學雜志，2016； 21( 1) : 27-33.

[11]歷金雷，蔡劍輝，任約翰，等. NＲAS、BＲAF、KＲAS、PIK3CA 基因突變檢測在結直腸癌治療和預后中的臨床價值研究[J]．中國現代醫生， 2017； 55( 23) : 1-6.

[12]吳新新，馬杰，任鵬飛，等. 結直腸癌KＲAS、NＲAS 和BＲAF 基因突變與病理特征、吸煙和飲酒之間的相關性[J]．鄭州大學學報( 醫學版) ，2016； 51( 1) : 39-43.

[13]代云，鄭國華，李青. 結直腸癌患者BＲAF、KＲAS、NＲAS 和PIK3CA 基因突變與其病理特征的關系[J]． 臨床與病理雜志，2017； 37( 5) : 875-9.

[14]劉影，鄭細閏，朱亞珍，等. 252 例結直腸癌組織中KＲAS、NＲAS、BＲAF、PIK3CA 的基因突變分析[J]． 臨床與實驗病理學雜志，2016； 32( 8) : 851-9.

[15]祁秀敏，張熔熔，唐威，等. KＲAS、NＲAS 、BＲAF 基因突變聯合檢測在轉移性大腸癌中的意義[J]． 廣東醫學，2017； 38 ( 2) :276-9．