外周血 Th17、Treg 細胞水平在潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病中的比較研究

文章發(fā)表于：《胃腸病學和肝病學雜志》

作者：尚瑞、吳軍、盧光新、楊艷果（湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院）；鄭雪皎（湖北十堰藥學部）

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【摘要】  

目的：觀察潰瘍性結(jié)腸炎( UC) 和克羅恩病( CD) 外周血單個核細胞 ( PBMCs) 中 Th17、Treg 細胞水平和 IL-17 mRNA 表達水平的差異。 探討 Th17 和Treg 在UC 和CD 發(fā)病機制中的作用。

方法：選取2014 年1 月 - 2015 年12 月在湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院住院治療的 IBD 患者 100 例，其中 UC 患者 50 例，CD 患者 50 例，應(yīng)用流式細胞儀技術(shù)檢測兩組患者外周血中 Th17 與 Treg細胞比例。 應(yīng)用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測兩組患者IL-17 和Foxp3 mRNA 水平的變化。

結(jié)果：CD 患者組外周血 Th17 細胞比例為(2. 01 ± 0. 59)% ，UC 患者外周血 Th17 細胞比例(4. 55 ± 0. 75)% ，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義( P < 0. 05)；CD 患者組外周血reg 細胞比例為(6. 08 ± 2. 10)% ，UC 患者為(3. 27 ± 0. 97)% ，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義( P < 0. 05)。 UC 患者組 IL-17 mRNA 水平約是 CD 患者的 4. 5 倍；UC 患者組 Foxp3 mRNA 水平約是 CD 患者的 0. 4 倍，差異均具有統(tǒng)計學意義( P < 0. 05)。

結(jié)論：Th17 與Treg 細胞比例在 UC 和 CD 中有顯著性差異，可為臨床 UC 和 CD 提供新的診斷方法，從而提高 UC 和 CD 診斷的正確率。

【關(guān)鍵詞】炎癥性腸病；潰瘍性結(jié)腸炎；克羅恩病；Th17 細胞；Treg 細胞；IL-17；

炎癥性腸病( inflammatory bowel disease， IBD)，是一種常見的慢性特發(fā)性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病( Crohn’ s disease，CD) 和潰瘍性結(jié)腸炎( ulcera- tive colitis， UC)。 近些年來 IBD 的發(fā)病率呈出急速增長的趨勢[1-2] 。 其確切發(fā)病機制雖然至今未知， 但是有研究數(shù)據(jù)表明，其發(fā)病的部分原因是由于易感體質(zhì)腸道菌群放松了對宿主的免疫反應(yīng)[3-4] 。 免疫反應(yīng)在其發(fā)病機制中發(fā)揮著最主要的作用，而 CD4 + CD25 + Foxp3 + 調(diào)節(jié)性 T 細胞( Treg ) 和輔助性 T 細胞 17 ( Th17) 是參與免疫反應(yīng)的兩種關(guān)鍵性細胞。 Treg 和Th17 是異于 Th1 和 Th2 的 CD4 + T 淋巴細胞。 Treg 細胞是 CD4 + T 細胞的一類特殊分支，主要作用是維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及耐受性，并且在防止免疫炎癥反應(yīng)的增加和保護免疫機體上也發(fā)揮重要作用。近幾年，在許多動物和人的研究中得知，丟失 Treg 細胞將會造成嚴重的自身免疫性炎癥的發(fā)生；相反，增加Treg 細胞也不利于機體健康，在許多癌癥中，增加的Treg 細胞通過與自身免疫監(jiān)控系統(tǒng)相互作用，抑制抗腫瘤免疫活性細胞的活性， 促進腫瘤發(fā)生、 發(fā)展。Foxp3 是 Treg 細胞的特異性標記物， 作為轉(zhuǎn)錄因子Forkhead 家族的一員，具有調(diào)控 Treg 細胞生長發(fā)育的作用。 而特異性產(chǎn)生 IL-17 的 Th17 細胞則被認為是存在于天然性免疫系統(tǒng)與獲得性免疫系統(tǒng)之間的橋梁，是炎癥反應(yīng)的使動和調(diào)節(jié)因素[5-8] 。 Th17 細胞在固有免疫、適應(yīng)性免疫和自身免疫方面均發(fā)揮至關(guān)重要的作用。 Th17 細胞在炎癥反應(yīng)的過程中主要發(fā)揮促進炎癥反應(yīng)的功效。

Treg 細胞和 Th17 細胞之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，在分化上二者相互協(xié)同，在功能上又相互競爭， 其平衡在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用。 目前，Th17 / Treg 兩種細胞的平衡紊亂已成為新的研究熱點，但是在CD 和 UC 中研究很少。 所以本文主要就兩種細胞在 UC 和 CD 中存在的比例差異進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 

選取 2014 年 1 月 - 2015 年 12 月在湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院住院治療的 IBD 患者，UC患者(活動期)50 例，男女比例為 28∶ 22，年齡(45. 45 ± 8. 34) 歲，CD 患者( 活動期)50 例，男女比例為 26∶ 24，年齡(48. 35 ± 7. 56) 歲。 診斷標準按照中華醫(yī)學會消化道學分會制定的關(guān)于 IBD 診斷標準[9] 。 兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義( P > 0. 05)，具有可比性。兩組患者均采集肘靜脈肝素抗凝血 2. 0 ml 和 EDTA抗凝血 2. 0 ml。

1.2  納入及排除標準

1.2.1 納入標準：(1) UC 的納入標準：連續(xù)性結(jié)膜、無肉芽腫、結(jié)直腸受累；(2) CD 的納入標準：從口腔至肛門慢性肉芽腫損害；呈跳躍性，延長軸或腸周或分散的潰瘍的非連續(xù)性病變；活檢黏膜可見黏蛋白滯留。

1.2.2 排除標準：(1) 以各種有效的診斷方法，如細菌學、放射學、組織學排除感染性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、放射性結(jié)腸炎等；( 2 ) 懷疑有結(jié)腸癌變的患者；(3) 心、腎功能顯著下降的患者；(4) 存在其他免疫學疾病的患者。 所有入選患者均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準，并且需取得每位患者的同意并簽署相應(yīng)的書面同意書。

1.3  試劑和儀器

1.3.1 試劑：布雷非得菌素 A( BFA)、4% 多聚甲醛( PFA)、細胞因子刺激劑( PMA)。 FITC-IL-17 流式抗體， APC-CD4 流式抗體， FITC-CD25 流式抗體， PE-Foxp3 流式抗體均購自美國 BD 公司。 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量 PCR 試劑盒購自中國全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 儀器：流式細胞儀( 美國 BD 公司)；實時 PCR儀( Life Technologies)。

1.4 流式細胞術(shù) 

用流式細胞術(shù)檢測兩組患者外周血 PBMCs 中細胞亞群 Th17 和 Treg 的比例。 用 IL-17抗體染色結(jié)果顯示為陽性的細胞群稱作Th17 細胞，將CD4 + CD25 + Foxp3 + 三種抗體染色均顯示為陽性的細胞群稱作 Treg 細胞。

1.4.1 Th17 細胞的檢測：用含有 100 g / L 胎牛血清( FBS) 的 1640 培養(yǎng)基，將 PBMCs 的濃度調(diào)節(jié)為 (1 ~5) × 105 個/ ml； 一支試管加入淋巴細胞刺激劑混合液 3 μl( 對照組不加淋巴細胞刺激劑混合液)；將試管放置于 37 ℃ ，且體積分數(shù) 5% CO2 細胞培養(yǎng)箱中，孵育5 h；孵育完成后以 800 r / min 離心 5 min，去上清液；用 2 ml PBS 清洗兩次，800 r / min 離心 5 min；加入固定劑 100 μl，于漩渦震蕩器上震蕩 2 ~ 5 s 混勻，然后避光， 室溫孵育 15 min，后加入 3 ml PBS 洗液，800 r / min 離心 5 min，棄上清；加入100 μl 破膜劑，避光孵育5 min，后不需清洗直接加入FITC-IL-17 流式抗體 10 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育 30 min； Th17 細胞同型對照管則需要加 10 μl FITC-Ig G 單克隆熒光抗體；500 μl PBS 液重懸細胞，待測。

1.4.2 Treg 細胞的檢測：取流式細胞儀上樣管；每管加入 APC-CD4、FITC-CD25、PE-Foxp3 各 10 μl；每管加 APC-lg G1，F(xiàn)ITC-Ig G1、PE-Ig G1 各 10 μl( 作為對照管)，其中這三種流式抗體分別做一個單個抗體對照，以便于流式上機檢測時補償?shù)恼{(diào)節(jié)； 加入 100 μl 抗凝全血，于漩渦震蕩儀上振蕩 2 ~ 5 s 混勻，避光室溫作用 30 min 后加入 500 μl 溶血劑，振蕩混勻，放置 37 ℃ 水浴箱中孵育 15 min； 待管內(nèi)液體透明后， 以 800 r / min 離心 5 min，然后將上清倒掉后加入 500 μl PBS 重懸細胞，待測。

1.5 實時定量

PCR( RT-PCR)   RT-PCR 檢測技術(shù)用于檢測 PBMCs 中細胞對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。 Th17 細胞檢測 IL-17，而 Treg 細胞檢測 Foxp3。

1.6 統(tǒng)計學方法  

釆用 SPSS 17. 0 軟件進行資料分析。 在開始檢驗前先對要處理的數(shù)據(jù)進行方差齊性以及正態(tài)性檢驗。 計量資料以 x ± s 表示，兩組之間的比較選用 t 檢驗。 P < 0. 05 為差異統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血 PBMCs 中 Th17 和 Treg 細胞比例

CD組患者外周血 Th17 細胞比例為(2. 01 ± 0. 59)% ，UC組患者外周血 Th17 細胞比例為(4. 55 ± 0. 75)% ，UC 組患者 Th17 細胞比例明顯高于 CD 組，差異有統(tǒng)計學意義( P < 0. 05)。

Treg 細胞：CD 組外周血 Treg 細胞比例為(6. 08 ± 2. 10)% ，UC 組為(3. 27 ± 0. 97)% ， CD 組 Treg 細胞比例明顯高于 UC 組，差異有統(tǒng)計學意義( P < 0. 05)。

2.2 兩組患者 PBMCs 中 IL-17 和 Foxp3 mRNA 水平變化

UC 組 IL-17 mRNA 水平約是 CD 患者的 4. 5 倍，而 UC 組 Foxp3 mRNA 水平約是 CD 組的 0. 4 倍，差異有統(tǒng)計學意義( P < 0. 05)。

3 討論

IBD 是典型的消化系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)是腹瀉、黏液膿血便、腹痛、里急后重等。 90% 以上患者都有腹瀉，輕者每日排便 3 ~ 4 次或腹瀉與便秘交替，重者每日可達 10 ~ 30 次。 且反復(fù)發(fā)作，屬慢性疾病。

IBD 是一種誘因以及致病因素迄今尚且未完全闡明的腸道炎癥性疾病。 近年來，越來越多的研究認為， 免疫調(diào)節(jié)紊亂、基因遺傳是致病和發(fā)病機制的因素之一，但是免疫異常誘因在各種研究中占有重要地位。Th17 細胞參與了系統(tǒng)免疫紊亂發(fā)生過程，Th17 細胞和 Treg 細胞數(shù)量和( 或) 功能的相互作用( 變化及轉(zhuǎn)化) 可能是 IBD 的致病、發(fā)病的罪魁禍首[10-11] 。 Th17與 Treg 細胞的失衡這一新的發(fā)現(xiàn)，給我們帶來了治療IBD 的新靶點，我們可以通過各種干預(yù)手段把 Th17 / Treg 細胞進行權(quán)重配比以達到最初無炎癥時的平衡狀態(tài)，從而達到預(yù)防與治療的作用。 其實，這已成為了研究的熱點，也是未來發(fā)展新方向。

不過，由于體內(nèi)環(huán)境錯綜復(fù)雜，所以在這個層面上還有很多亟待解決的問題，如在體內(nèi)消減 Treg 細胞的安全方法、在體內(nèi)的相互影響機制及操作穩(wěn)定性等。因此，我們?nèi)孕鑼?Th17 / Treg 細胞進行更深入的研究， 從而為 IBD 預(yù)防和治療提供新的思路。

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