膀胱癌中巨噬細胞浸潤與膀胱癌化療耐藥的研究

文章發表于：《中國現代醫學雜志》

作者：1. 康川疆 、姜睿（ 西南醫科大學附屬醫院） 2. 周艷（ 四川省遂寧市第三人民醫院）

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【摘要】

目的：探究膀胱癌分泌趨化因子生長調節基因 5（CXCL5）招募巨噬細胞對膀胱癌化療耐藥的影響。

方法：應用 Transwell 小室招募實驗檢測不同處理條件下對人急性單核細胞白血病細胞系（THP-1）招募能力改變 ；使用 Western blot 測定 CXCL5、PARP/cleaved-PARP 蛋白水平改變 ；通過 qRT-PCR 檢測 CXCL5 的 mRNA 水平改變 ；使用 MTT 實驗測定巨噬細胞及多柔比星處理對膀胱癌增殖能力的影響。

結果：膀胱癌細胞相對正常膀胱上皮細胞招募更多的 THP-1（P <0.05）；膀胱癌細胞相對正常膀胱上皮細胞 CXCL5 在蛋白水平和 mRNA 水平表達上調（P <0.05）；膀胱癌細胞中 CXCL5 敲減能抑制膀胱癌細胞對 THP-1 細胞的招募能力（P <0.05）；巨噬細胞與膀胱癌細胞共培養后再加入多柔比星 cleaved-PARP 上調減弱，細胞存活率增加（P <0.05）。

結論：膀胱癌細胞能分泌 CXCL5 招募過多的巨噬細胞促進膀胱癌化療耐藥。

【關鍵詞】膀胱癌 ；趨化因子生長調節基因 5 ；巨噬細胞 ；多柔比星耐藥；

膀胱癌是泌尿系統常見腫瘤之一，因其發病率高、術后復發率高以及致死率高等特點導致膀胱癌治療頗為困難 [1]。膀胱癌微環境在腫瘤進展和治療中發揮重要功能 [2]，腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages， TAMs）是腫瘤微環境的重要組成部分， 相對于癌旁組織，腫瘤組織中腫瘤相關巨噬細胞明顯增加，被激活為 M2 型巨噬細胞后釋放大量細胞因子， 促進膀胱癌的進展 [3]。

趨化因子生長調節基因 5[chemokine（C-X-C motif）ligand 5， CXCL5] 屬于趨化因子 CXC 中 ELR 趨化因子的一員，最新研究發現 CXCL5 具有促進腫瘤增殖、血管形成、粒細胞趨化及促進炎癥反應等功能 [4-5]，本研究旨在探究膀胱癌通過分泌 CXCL5 招募巨噬細胞以及巨噬細胞對膀胱癌化療耐藥性的影響，為膀胱癌治療提供新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常膀胱上皮細胞 SV-HUC-1、人膀胱癌細胞系 T24、253J 及人急性單核細胞白血病細胞系 THP-1 細胞購自中國科學院昆明細胞庫，DMEM 培養基和RMPI-1640 培養基購于美國 Life Technologies 公司， 胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，佛波酯（phorbol 12-myristste 13-acetate， PMA）、IL-4 購自美國 Sigma-Aldrich 公司，Transwell 小室購自美國Coming 公司，Fibronectin 購自美國 Life Technologies 公司，RNA 提取試劑盒購自上海飛捷生物技術有限公司，RNA 反轉試劑盒及PCR kit 購自日本TaKaRa 公司， CXCL5 敲減 shRNA 慢病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司，CXCL5 多克隆抗體購自美國 Santa Cruz 公 司，PARP/cleaved-PARP 購 自 美 國 Cell Signaling Technology（CST）公司。

1.2 細胞培養及 shRNA 慢病毒轉染

膀胱癌細胞 T24、253J 使用含 10% 胎牛血清DMEM 培養基培養，人正常膀胱上皮細胞 SV-HUC-1 和急性單核細胞白血病細胞系 THP-1 細胞使用含10% 胎牛血清 RMPI 1640 培養基培養，培養基內加入 100 μg/ml 青霉素和鏈霉素（Sigma， USA）， 置于 37℃、5% 二氧化碳 CO2 培養箱，每 2 ～ 3 天對細胞換液處理，貼壁細胞每 4 ～ 5 天通過胰酶消化進行傳代處理，THP-1 細胞離心重懸進行傳代處理。每次實驗前使用 160 nmol/L PMA 細胞培養 24 h，誘導 THP-1 細胞分化成巨噬細胞。shRNA 慢病毒預實驗感染確定T24 細胞 MOI 值為 5、253J 細胞 MOI 值為 10。調整細胞密度將 T24、253J 細胞接種于 6 孔板中，轉染前用 DMEM 培養液清洗細胞，使用 Complete Mdeium 稀釋 polybrene 至終濃度 50 μg/ml，細胞加入 5 μg/ml 的polybrene 和相應體積病毒轉染T24、253J 細胞 48 h 后， 使用 2 ～ 3 μg/ml 嘌呤霉素進行細胞篩選 2 ～ 3 周，熒光顯微鏡下檢測熒光蛋白表達，實時熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測 CXCL5 的 mRNA 和蛋白表達。

1.3 人正常膀胱上皮細胞和膀胱癌細胞條件培養基提取

人正常膀胱上皮細胞和膀胱癌細胞正常培養，胰酶消化離心后重懸，調整細胞數量為 2.0×106 個/皿 接種于 10 cm 皿中，待細胞貼壁后更換無血清培養基， 將 10 cm 皿置于 37℃、5% CO2 培養箱培養 48 h，吸取細胞上清液離心去除細胞碎屑，吸取離心后上清液置入 -20℃冰箱冷凍保存備用。

1.4 THP-1 源性巨噬細胞條件培養基提取

THP-1 細胞離心重懸，細胞計數并按 2.0×106 個/ 皿接種于 10 cm 皿中，PMA 誘導培養 24 h，更換新的培養基，再加入 20 ng/ml 的 IL-4 繼續培養 24 h，更換無血清培養基，置于 37℃、5% CO2 培養箱培養 48 h，吸取細胞上清液離心去除細胞碎屑，吸取離心后上清液置入 -20℃冰箱冷凍保存備用。

1.5 四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測膀胱癌細胞增殖能力變化

膀胱癌細胞正常培養，待細胞生長至 70%~80% 消化進行細胞計數，調整細胞密度為 3.0×105 個 /ml，按照每孔 200 μl 接種于 96 孔板中，待細胞貼壁后實驗組按照 1 ∶ 1 比例加入巨噬細胞條件培養基共培養36 h，加入濃度為 2.0 μmol/L 多柔比星，每種處理設置 5 個復孔，將 96 孔板置于 37℃、5% CO2 培養箱培養 24 h，吸去上清液，每孔加入含有 10% MTT 的培養基培養 4 h，吸去上清液加入 150 μl DMSO/ 孔，置于微量振蕩器勻速振蕩 10 min，對照組未加入巨噬細胞條件培養基。應用酶聯免疫檢測儀在 490 nm 處檢測光密度（OD）值，做出細胞生長曲線。

1.6 THP-1 細胞招募實驗

取 5μm Transwell 小室，倒置放置于 10 cm 皿中， 小室下室膜上滴加 20 μl Fibronectin 并均勻鋪滿，放置于 37 ℃、5% CO2 培養箱中 4 ～ 6 h 備用。THP-1正常培養，離心后使用無血清培養基重懸，細胞計數并調整細胞密度為 2.5×105 個 /ml，取出已包被 Fibronectin 的小室取出置于 24 孔板中，小室下室加入 1 ∶ 1 稀釋的無血清條件培養基，上室加入 200 μl 的THP-1 細胞懸液，將 24 孔板置于 37℃、5% CO2 培養箱培養 36 h，棉簽擦拭小室上室細胞，使用 4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS 清洗加入結晶紫染色 20 min， 再次使用 PBS 清洗小室并使用棉簽擦拭上室殘留細胞，顯微鏡隨機選取 5 個視野拍照，實驗重復 3 次。

1.7 實時熒光定量 PCR 檢測相關 mRNA 表達

使用胰酶消化并傳代細胞接種于 6 孔板中，待細胞密度至 60% ～ 70% 時按照飛捷 RNAfast 200 試劑說明書操作提取 RNA，cDNA 模板通過 RNA 逆轉錄獲得，逆轉錄體系參照 TaKaRa Prime ScriptTM RT Master Mix 試劑說明書。CXCL5 的 mRNA 表達檢測使用TaKaRa SYBR @ PrimixEx TaqTM  Ⅱ反應體系，引物序列，正向5'-GACGGTGGAAACAAGGAAAA-3'，反向GCTTA AGCGGCAAACATAGG- -3'。使用ß -actin作為內參，正向
5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC- 3'，反向5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。mRNA的表達水平采用2△△Ct  計算 方法進行分析。T24和253J兩種細胞系未加入CXCL5敲減shRNA慢病毒作為對照。

1.8 Western blot 檢測相關蛋白表達

使用胰酶消化并傳代細胞接種于 6 孔板中，待細胞密度至 60% ～ 70% 時加入細胞裂解液提取蛋白， 使用 BCA 法測定所提取蛋白濃度。取 30μg 蛋白使用 SDS-PAGE 凝膠進行分離并轉膜處理，PVDF 膜使用 5% 脫脂牛奶常溫封閉 1 h，加入目的抗體 CXCL5、PARP/cleaved-PARP、β-actin，放置在 4℃冰箱搖床慢搖過夜孵育。使用 TBST 洗膜液洗膜 10 min×3 次， 加入二抗孵育，并置于常溫搖床 1 h，TBST 洗膜液洗膜 10 min×3 次，使用 ECL 顯影液進行顯影。目的蛋白表達量通過與內參蛋白 β-actin 標準化后得到相對比值。

1.9 統計學方法

數據分析采用 SPSS 18.0 統計軟件，計量數據以均數 ± 標準差（x±s）表示，對計量資料組間比較采用多因素方差分析及 LSD-t 檢驗，P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膀胱癌細胞與正常膀胱上皮細胞招募 THP-1 細胞

SV-HUC-1 組 招 募 THP-1 細 胞 數（85.400±5.528），膀胱癌細胞 T24 和 253J 組招募 THP-1 細胞數分別為（288.200±6.028）和（348.600±8.583），與正常膀胱上皮細胞比較，差異有統計學意義（t  =42.950和 44.650，均P =0.000），顯示膀胱癌細胞相對正常膀胱上皮細胞招募更多的 THP-1 細胞。

2.2 膀胱癌細胞與正常膀胱上皮細胞 CXCL5 表達水平

T24 組與 253J 組膀胱癌細胞 CXCL5 的 mRNA 表達水平分別為（5.871±0.345）、（6.238±0.472）， 與正常膀胱上皮細胞（1.000±0.413）比較，差異有統計學意義（t =15.680 和 14.470，均P =0.000），CXCL5在膀胱癌細胞中表達升高。見圖 1。 

2.3 膀胱癌細胞 CXCL5 敲減對 THP-1 細胞浸潤的影響

敲減膀胱癌細胞 CXCL5 表達見圖 2。膀胱癌細胞系 T24 敲低組招募 THP-1 細胞數，與對照組比較， 差異有統計學意義（P <0.05）。253J 細胞敲低組招募 THP-1 細胞數，與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05），顯示 CXCL5 敲減抑制膀胱癌細胞對THP-1 細胞招募能力。見表 1。

2.4 T HP-1 源性巨噬細胞對膀胱癌對多柔比星抵抗性的影響

膀胱癌細胞系T24 共培養組細胞存活率，與對照組比較，差異有統計學意義（P <0.05）。253J 共培養組細胞存活率，與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05），THP-1 源性巨噬細胞共培養可以增強膀胱癌細胞對多柔比星的抵抗性。見表 2。

3 討論

腫瘤微環境是腫瘤發生、發展過程中重要機制， TAMs 在腫瘤進展中發揮重要功能，既往報道發現TAMs 在腎癌 [6]、肝癌 [7]、肺癌等 [8] 多種惡性腫瘤疾病中浸潤增加，本研究發現在膀胱癌中，膀胱癌細胞招募 TAMs 能力高于正常膀胱上皮細胞，TAMs 很可能在膀胱癌惡性進展中起到關鍵作用。

CXCL5 是 CXC 族趨化因子成員 [9]，趨化因子主要作用是作為化學引誘物介導細胞特異性遷移，吸引相關炎癥細胞的組織浸潤。研究發現 CXCL5 在前列腺癌 [10]、乳腺癌 [11]、胰腺惡性腫瘤 [12] 和腎癌 [13] 中高表達，而有關 CXCL5 在膀胱癌中對 TAMs 招募作用尚未報道。本研究通過實驗發現膀胱癌細胞 CXCL5 表達高于正常膀胱上皮細胞，且 CXCL5 敲減能抑制膀胱癌細胞對 THP-1 細胞招募能力，說明 CXCL5 在膀胱癌細胞對 THP-1 細胞招募過程中發揮重要功能。

TAMs 促進腫瘤的生長、侵襲和轉移，同時 TAMs 高浸潤增強多種惡性腫瘤如乳腺癌或胃癌患者對化療藥物耐藥及引起預后不良 [14-16]，因此筆者想要探討腫瘤相關巨噬細胞對膀胱癌細胞化療耐藥產生的影響，發現共培養后加入多柔比星相對多柔比星對照組化療藥物對膀胱癌細胞殺傷作用明顯下降，說明腫瘤相關巨噬細胞可以促進膀胱癌細胞對多柔比星的化療耐藥性。

綜上所述，膀胱癌細胞通過分泌過多的CXCL5招募巨噬細胞，同時招募的腫瘤相關巨噬細胞能夠反向性作用于膀胱癌細胞,增強膀胱癌的化療耐藥性，對膀胱癌的治療提供了新的思路。

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