DNA異常甲基化與結直腸癌研究進展

文章發表于：《廣西醫學》

作者：1. 劉綱毅 、張明明（廣西科技大學附屬柳州市人民醫院） 2. 黃志卓（廣西醫科大學第四附屬醫院柳州市工人醫院）

本文由網友“歲月靜好”推薦（請勿轉載）

【摘要】

結直腸癌是常見的一種惡性腫瘤，其主要發病機制為不可逆轉的基因系列改變以及可逆轉的表遺傳修飾。DNA甲基化是腫瘤發生的重要表觀遺傳學變化，并已被證實與結直腸癌的發生發展密切相關。本文就結直腸癌遺傳學機   制以及結直腸癌相關基因的DNA異常甲基化在結直腸癌中的發生、診斷與治療中的研究情況進行綜述，總結通過分子診斷技術利用結直腸癌相關基因的DNA異常甲基化作為生物標志物，用于結直腸癌的無創性篩查、早期檢測、診斷、預測和預后的進展，為結直腸癌的診療提供新的方法和思路。

【關鍵詞】 結直腸癌；表遺傳學修飾；脫氧核糖核酸；甲基化；篩查；診斷

結直腸癌是最為常見的惡性腫瘤之一，全球每年新診斷病例超過100萬，其死亡率超過30%[1-2]  o美國癌癥協會統計顯示，2013年美國約診斷14萬新發結直腸癌患者和約5萬結直腸癌死亡患者[3] 。結直腸癌的發生發展是一個涉及多因素和多步驟的復雜而緩慢的過程，除與飲食習慣、生活方式、生活環境等外界因素有關外，結直腸癌主要的發病機制涉及不可逆轉的基因系列改變，和可逆轉的表遺傳修飾。表遺傳學是指發生在可遺傳的基因表達上的修飾而未涉及DNA系列的改變。基因表達的表遺傳調控可發生在正常組織并在胚胎發育、基因印跡和細胞分化中起著重要的作用。表遺傳機制目前被認為在腫瘤中扮演重要角色，主要包括DNA異常甲基化、組蛋白翻譯后修飾、微小RNA和非編碼RNA等[4]。本文主要對DNA異常甲基化在結直腸癌中的發生、診斷與治療中的研究情況進行綜述。

1. 結直腸癌的遺傳學機制

結直腸癌患者多為散發性病例，20% ~ 25%的結直腸癌患者具有家族史，但僅5% ~ 6%的結直腸癌患者與主要的高外顯率結直腸癌基因遺傳性突變(遺傳綜合征)相關。結直腸癌遺傳綜合征主要包括遺傳性非息肉性結直腸癌和家族性腺瘤性息肉病。而75%~80%的散發性結直腸癌病例多由易感性基因和環境因素相互作用引起[3-6]。遺傳學表現為基因系列發生點突變、插人缺失突變等變化而弓起基因表達的改變。引發結直腸癌的突變基因包括原癌基因抑癌基因和DNA錯配修復基因，原癌基因主要有大鼠肉瘤病毒癌基因同源物( V-KI-RAS2 Kirsten  rat sarcoma viral oncogene homolog， KRAS)和鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體(v-Rafmurine sarcoma viral oncogenehomologueB1，BRAF)，抑癌基因主要為結腸腺瘤樣息肉( adenomatosis polyposis coli， APC)蛋白、腫瘤抑制蛋白( tumor protein p53 ，TP53 )和Sma-Mad族蛋白2/4( Sma-andMad-related protein， SMAD)， DNA錯配修復基因主要為MutL同種蛋白1( mutL homolog-1， MLH1 )和Mut S同種組織蛋白2( mutS homolog 2， MSH2)。這些基因的突變導致相關信號通路的異常，如位于表皮生長因子受體( epidermal growth factor receptor， EGFR)的原癌基因KRAS的信號通過BRAF激活受體絡氨酸介導的一系列多個信號通路[3，7-13]，基因組的不穩定則加速基因突變的累積，導致癌細胞持續增殖。在結直腸癌病例中至少存在兩種基因組不穩定形式：微衛星不穩定性( microsat-ellite instability， MSI)和染色體不穩定( chromosomalinstability ， CIN)。在散發性結直腸癌中，約15%的患者存在MSI，85%的患者存在CIN[14]。

2. 結直腸癌常見相關基因的異常甲基化

DNA甲基化是最具特征性也是最為重要的表遺傳學修飾，是指由DNA甲基轉移酶催化，把S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉移到核苷酸對( cytosine-phosphate-guanine ，CpG)二核苷酸的胞嘧啶5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶從而影響基因表達的過程[15]。

2.1 DNA甲基化與結直腸癌

在正常基因組上，70% ~ 80%的CpG均發生甲基化，而CpG島(啟動子上富含CpG的區域)通常未發生甲基化[16-18]。在腫瘤組織上則相反，表現為全基因組的低甲基化和啟動子區域，特別是抑癌基因啟動子的過度甲基化[15]。全基因組的低甲基化可引起基因組的不穩定及可激活正常情況下沉默的基因區域如原癌基因15，191，啟動子區域的過度甲基化則使抑癌基因、DNA修復基因、細胞周期控制基因、調亡基因等發生異常沉默[20-21)。研究表明，結直腸癌可有多種基因的異常甲基化[6.22-23]， 筆者總結了與結直腸癌相關的甲基化基因，見表1和表2。這些基因的啟動子發生高甲基化后被沉默，進而促進結直腸癌的形成與發展。腫瘤組織的多啟動子甲基化可形成CpG島甲基化表型( CpG island methylator phenotype ， CIMP) ，CIMP與老年、女性、結直腸癌家庭史、近端結腸、黏液性細胞的分化、特異性癌前病變、吸煙、MSI及KRAS和BRAF突變相關”。結直腸癌可根據CIMP的存在或缺乏及關鍵基因突變分為不同的型別[24-25]  就表遺傳學觀點而言，結直腸癌可分為CIMP +和CIMP -，并建議分為3個亞群：(1)CIMP1腫瘤，常表現為MSI( 80% )和BRAF 突變(53% )；(2)CIMP2腫瘤，常見KRAF突變(92% )，但少見MSI、BRAF突變或TP53突變；(3)CIMP-腫瘤，該亞群TP53突變出現頻率較高[24]，最近研究顯示，高CIMP亞群腫瘤出現頻率非常高的腫瘤特異性DNA高甲基化，并且與MLH1基因甲基化、BRAFV600E突變，以及女性相關；低CIMP亞群腫瘤與KRAS突變和男性相關；CIMP-亞群腫瘤表現為TP53突變，但腫瘤特異性基因突變和高甲基化的頻率較低且常發生在末端結腸和直腸， BRAF和KFAS基因為野生型[25 -26]。

結直腸癌的發生和發展是一個多步驟的過程，DNA異常甲基化可貫穿于腫瘤發展的所有階段，如表2所示。研究顯示，至少有6種甲基化基因(SLC5A8、SFRP1、SFRP2、CDH13. CRBP1和RUNX3)和2個甲基化位點( MINT1和MINT31 )存在于正常結腸上皮組織到異常腸隱窩病灶階段[22]；其他一些基因( p14、HLTFITGA4、CDKN2A/p16、CDH1和ESR1 )常發現于從異常腸隱窩病灶到息肉或腺瘤的階段；而TIMP3、CXCL12、ID4和IRF8基因可出現在息肉到癌變組織的階段；DNA修復基因MGMT和hMLH1甲基化在從息肉到癌變的過程亦起著重要的作用。基質細胞中編碼SPARC基因的甲基化與結直腸癌的淋巴管浸潤轉移相關[27]。

表1  與結直腸癌相關的常見甲基化基因

表2 DNA異常甲基化與結直腸癌診斷進展、預后和治療分類

2.2  DNA甲基化與結直腸癌篩查和診斷 

 結直腸癌是一種具有高死亡率但癌前階段時間較長的腫瘤，如果能夠在高危人群建立大規模的篩查，就可以得到早期的診斷與治療。研究表明，如果在未發生轉移的局部病變的結直腸癌早期階段得到診斷與治療，患者5年生存率超過90%，明顯高于已發生轉移的晚期結直腸癌患者的11 %[28 -30]。結直腸癌的篩查方法一般分為兩種：(1)基于結構上的檢查和基于糞便或外采血液標本的檢測，前者如各種腸鏡檢查，是一種侵入性的檢測方法，但可檢測早期癌變和腺瘤性息肉；(2)基于糞便或外采血液標本的檢測包括潛血、免疫化學檢測和脫落細胞DNA檢測，這些方法為無創性的檢查，但具有較低的敏感性。糞便或外周血漿DNA檢測是唯  種以分子生物標志物為檢測物，分子生物標志物較潛血等具有更高物特異性。SEPT9、VIM、TMEFF2、ITGA4、ALX4和HLTF等均是與結直腸癌有較高相關性的基因，且可能過甲基化特異性PCR( methylation -specific PCR， MSP)或巢氏甲基化特異性PCR( hemi-nested methylation-specific PCR ， hn-MSP)或熒光定量MSP(quantitativeMSP，qMSP)及甲基化敏感高分辨率熔解曲線( methylation -sensitive high resolution  melting，MS-HRM)從血液或糞便中檢測 [31 - 38]。

SEPT9基因與細胞質分裂相關，其有特殊的結構特征并且在多種腫瘤中存在差異表達。SEPT9 基因啟動子甲基化是近年來發現的比較特異的結直腸癌標志物。血漿或糞便中檢測SEPT9基因啟動子甲基化對結直腸癌的敏感度可在70%以上，特異性在83%~94%[31 -36]有研究顯示，術前結直腸癌患者血漿中SEPT9啟動子甲基化檢測陽性率為95.6%，I~V級結直腸癌的SEPT9陽性率達100.0%，I級為84.0%，特異性為84.8%；而在行結腸鏡檢查前的無疾病跡象樣本的陽性率為15.6%，特異性為99%[33]；該研究還顯示，糞便潛血試驗和癌胚抗原( carcino embryonic antigen， CEA)在結直腸癌患者的敏感性分別為68.2%和51.8%，特異性分別為70.6%和85.2%，作者認為SEPT9啟動子甲基化檢測在結直腸癌的診斷中優于糞便潛血試驗和CEA。另外，結直腸癌特異性生物標志物VIM基因甲基化檢測的敏感度和特異性也可達到80%左右[39 -40]，因此在進行結直腸癌早期篩查時，可聯合檢測多種特異性相關標志物，進一步提高結直腸癌診斷的敏感性和特異性。
在甲基化檢測方法方面，MS-HRM的最低檢測限為1%，優于MSP技術的5%，但nMSP和qMSP可提高最低檢測限[34、41]。趙慧霞等[42]應用nMSP聯合變性高效液相色色譜技術檢測SEPT9基因可行到較好結果。

2.3  DNA甲基化與結直腸癌治療 

有學者[43]研究發現，一些異常甲基化基因可引起癌細胞對治療結直腸癌的常用3種藥物(氟尿嘧啶、伊立替康和奧沙利鉑)的敏感性或耐藥性發生變化。氟尿嘧啶的抗腫瘤活性主要是抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶( thymidylate synthase，TYMS)， 對氟尿嘧啶產生耐藥的主要機制是增加TYMS基因的表達。有證據表明，TYMS基因啟動子甲基化對 TYMS表達的調節比組蛋白乙酰化/去乙酰化更具相關性[43]  其他一些參與嘧啶代謝的基因也可能是氟尿嘧啶產生耐藥的潛在分子因素，如二氫嘧啶脫氫酶(dihy-dropyrimidine dehydrogenase ， DYPD)基因、胸苷磷酸化酶( thymidine phosphorylase ， TYMP)基因和尿苷-磷酸激酶( uridine monophosphate kinase ， UMPK)基因。DNA啟動子甲基化也是影響這些基因表達的主要機制。研究表明，SPARC基因表達水平下調同樣也可降低化療藥物(包括氟尿嘧啶和伊立替康)的敏感性，SPARC基因持續甲基化存在于結直腸癌組織中，但在正常結腸組織未發現甲基化[44]。伊立替康是拓撲異構酶1的抑制劑，UDP葡萄糖醛酸基轉移酶1A1 ( UDP-glucuronyl transferase ，UGT1A1 )對伊立替康具有脫毒作用，伊立替康的藥物基因組學主要基于UGT1A1的基因表型[45]，體外實驗表明，DNA甲基化可使UGT1A1基因沉默；也表明該基因發生表遺傳學修飾可能與伊立替康治療結直腸癌的敏感性相關[43]

3. 結語

結直腸癌的發生發展是遺傳學與表遺傳學相關基因發生改變和修飾及環境因素共同作用的一個緩慢過程。雖然本文主要綜述了結直腸癌相關基因的DNA異常甲基化，但表遺傳學的其他機制如組蛋白翻譯后修，飾、染色質重建、RNA介導的機制和遺傳學方面的相關基因突變、插入/缺失等也在結直腸癌的發生發展中起：重要作用。DNA異常甲基化的研究，對于結直腸癌的診斷、分期、轉移傾向、預后和治療等提供了新的方法和思路，并且已經在我們面前展現了良好的前景。

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